[发明专利]用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引物探针组，其特征在于，包括针对PRRSV的引物探针组和针对CSFV的引物探针组；

所述针对PRRSV的引物探针组包括具有如下核苷酸序列的引物和探针：

正向引物PRRSV-D1-F：5′-ACCTGGAAATTCATCACCTC-3′；

反向引物PRRSV-D1-R：5′-CGACAAATGCGTGGTTATCA-3′；

探针PRRSV-Probe：5′-FAM-TGCTAGGCCGCAAGTACATTC-BHQ1-3′；

所述针对CSFV的引物探针组包括具有如下核苷酸序列的引物和探针：

正向引物CSFV-D155-18F：5′-GGGTGGTCTAAGTCCTGA-3′；

反向引物CSFV-D325-18R：5′-CTAATAGTGGGCCTCTGC-3′；

探针CSFV-Probe：5′-ROX-CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-BHQ2-3′。

2.一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的正向引物PRRSV-D1-F、反向引物PRRSV-D1-R、探针PRRSV-Probe、正向引物CSFV-D155-18F、反向引物CSFV-D325-18R和探针CSFV-Probe。

3.根据权利要求2所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、逆转录混合酶、阴性对照品、PRRSV和CSFV的阳性对照品以及含有dNTP的PCR缓冲液。

4.根据权利要求3所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述PRRSV和CSFV的阳性对照品为PRRSV病毒的阳性质粒与CSFV病毒的阳性质粒的混合品，所述混合品中PRRSV病毒的阳性质粒与CSFV病毒的阳性质粒的浓度均为2.4×10^-4ng/ul；所述阴性对照品为无菌DEPC-H₂O。

5.根据权利要求4所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述PRRSV病毒的阳性质粒是以PRRSV ORF6基因序列保守片段中如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列为靶目标序列扩增所得产物与载体连接构建的重组质粒，扩增所用引物对具有如下核苷酸序列：

PRRSV-SF：5′-TTTCAGCGGAACAATGGGGTC-3′；

PRRSV-SR：5′-TTTCTGCCACCCAACACGAGG-3′；

所述CSFV病毒的阳性质粒是以CSFV 5′UTR基因序列保守片段中如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为靶目标序列扩增所得产物与载体连接构建的重组质粒，扩增所用引物对具有如下核苷酸序列：

CSFV-S149-18F；5′-CTCCCTGGGTGGTCTAAG-3′；

CSFV-S729-18R；5′-GCTACCTGTCACCCTACC-3′。

6.一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、提取待测样本的基因组，以所得基因组RNA为模板，利用权利要求1所述引物探针组进行二重RT-PCR扩增，并在每个循环延伸结束时进行荧光信号检测；

步骤二、对步骤一扩增所得PCR产物进行分析，基于特定扩增曲线生成情况及Ct值判断待测样本是否含有PRRSV和/或CSFV。