[发明专利]一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合以及方法

权利要求书

1.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括序列为SEA ID NO：1～86的多重PCR引物。

2.如权利要求1所述检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于包括由特异性扩增人群α-地贫基因的SEA、4.2kb、3.7kb三种缺失型突变的引物20对，和WS、QS、CS三种点突变的引物1对，以及包括α-珠蛋白基因HBA1、HBA2特异扩增Alpha缺失区域的连锁SNP位点区域和HBA基因下游1-2Mb范围内紧密连锁的SNP位点的引物65对。

3.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，使用了如权利要求1或2任意一项所述检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，包括如下步骤：

步骤一：提取待测夫妻双方外周血DNA以及胚胎细胞进行全基因组扩增：对外周血进行DNA提取，富集外周血基因组DNA，并且将来自体外培养的第3-6天卵裂期或囊胚期滋养层细胞经过单细胞全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，对得到的DNA进行浓度测定；

步骤二：目标片段扩增：将步骤一富集后的DNA与多重PCR扩增试剂和上述引物组合混合，经多重PCR反应，得到扩增后的目的基因DNA片段；

步骤三：扩增产物纯化：将多重PCR反应后的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化的多重产物；

步骤四：末端补平：在步骤三得到的DNA片段中加入可与黏性末端结合的引物，与末端补平试剂混合并经过孵育，得到平末端的DNA样本；

步骤五：接头连接：将步骤四得到的平末端DNA样本与P1接头、adapter接头及接头连接反应试剂混合进行连接反应，得到连接接头的DNA片段；

步骤六：磁珠纯化：将步骤五连接接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头及多余的引物，得到纯化的连接接头DNA片段；

步骤七：文库扩增与检测：将步骤六纯化的连接接头DNA片段加入文库扩增引物及文库扩增反应试剂进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到目标片段的DNA文库，并对得到的DNA文库进行浓度测定。

步骤八：高通量测序：采用高通量测序平台对步骤七得到的DNA文库进行高通量测序；

步骤九：生物信息学分析：对胚胎活检细胞的全基因组扩增产物及家系全血DNA样本进行多重捕获测序后进行生物信息学SNP分析，获得夫妇双方及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序数据判断是否遗传了父母亲的致病单体型。

4.如权利要求3所述检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的方法，其特征在于，所述步骤二中的多重PCR反应条件为：

变性：95℃变性10min，1个循环

预扩增：预变性：94℃变性30s，；

退火：58℃退火2min、60℃退火3min、62℃退火1min；

延伸：72℃延伸1min；

退火+延伸5个循环；

富集扩增：变性：94℃ 20s

退火：66℃退火3min，25个循环；

4℃终止。