[发明专利]一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用

说明书

本发明提供了一种高效生产N‑乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明所述重组大肠杆菌以大肠杆菌E.coli ATCC25947(DE3)为出发菌株，过表达具有若干个T7_lac启动子控制的gna1基因与具有若干个T7_lac启动子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得，提高了N‑乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达180g/L，葡萄糖转化率56％，不产生乙酸和乳酸副产物，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是指一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。

现如今微生物发酵法是国内外生产GlcNAc的主要方法。所使用的基因工程菌主要为大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过在这些菌株中引入氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)和氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶(gna1)编码基因，以葡萄糖为原料，进行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。

对乙酰氨糖的生物合成研究表明，在大肠杆菌中，阻断GlcN的分解代谢途径以及异源表达gna1，定向进化内源glmS，此时GlcNAc产量达到110g/L，对葡萄糖转化率45％。在枯草芽孢杆菌中，采用理性代谢工程手段以及动态调控策略对代谢流进行了优化，GlcNAc产量达到了131.6g/L，对葡萄糖转化率38％。然而以上基因工程菌株中均存在较多副产物途径，导致了产量及转化率较低，工业化成本高。因此，进一步提高产量及转化率以降低生产成本成为目前微生物发酵法生产乙酰氨糖的重要问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明一种高效生产N-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用。为了提高乙酰氨基葡萄糖的产量和对葡萄糖的转化率，本发明通过阻断大肠杆菌细胞对乙酰氨糖的利用，过表达glmS及外源gna1，并且敲除了丙酮酸氧化酶(poxB)和乳酸脱氢酶(ldhA)，发酵过程中共同使用一定浓度的IPTG和乳糖进行诱导，从而提高了大肠杆菌生产乙酰氨基葡萄糖的能力，减少了副产物乙酸及乳酸的产生。具有重要的经济价值和社会意义。

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌为出发菌株，过表达具有若干个T7_lac启动子控制的gna1基因与具有若干个T7_lac启动子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得。

在本发明的一个实施例中，重组大肠杆菌以大肠杆菌E.coli ATCC25947(DE3)为出发菌株，过表达具有至少两个T7_lac启动子控制的gna1基因与具有至少一个T7_lac启动子控制的glmS基因，并敲除manX基因、manY基因、manZ基因、nagA基因、nagB基因、nagE基因、poxB基因和ldhA基因所得。

为了进一步提高GlcNAc的产量及转化率，选取了E.coli ATCC25947(DE3)为出发菌株，通过CRISPR/Cas9系统敲除了甘露糖转运子基因簇manXYZ和乙酰氨糖转运子基因簇nagABE，同时在这两个位点分别整合了T7_lac启动子控制下的glmS和gna1，并在岩藻糖异构酶和激酶fucIK位点增加了一个拷贝的T7lac-gna1。又进一步敲除了丙酮酸氧化酶poxB和乳酸脱氢酶ldhA。