[发明专利]一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法。本发明具体地公开了用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物、试剂盒、检测方法。本发明通过在同一个PCR反应体系中同时扩增靶基因和内参基因，计算靶基因和内参基因的Ct值差，综合野生型反应体系的△Ct值和突变型反应体系的△Ct值，判断基因是否发生突变。本发明选用的内参基因和检测基因位于同一条染色体上，同时使用了UNG酶/dUTP抗污染体系，降低假阳性结果的产生，具有准确性高，抗污染能力强，检测速度快，对仪器性能要求低的优点。本发明所述组合物、试剂盒及检测方法可以在体外准确地检出患者血液样本中苯丙氨酸羟化酶基因的突变。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常见的氨基酸代谢障碍性疾病,属常染色体隐性遗传病,该病的主要致病原因是苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)活性的降低或缺失导致苯丙氨酸在肝脏中的代谢紊乱，使得苯丙氨酸不能正常代谢为酪氨酸，在血液中堆积。苯丙酮尿症患者的血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，使得苯丙氨酸的旁路代谢途径代偿性增加，神经毒性物质过度积累，导致患者出现发育迟缓、智力障碍、语言障碍、癫痫抽搐、小头畸形、孤独症等不同程度的神经伤害。

苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)又称苯丙氨酸-4-单加氧酶，是一种由苯丙氨酸形成的酪氨酸加氧酶，其编码基因位于12号常染色体(参考GenBank登陆号：NG_008690.2)。苯丙氨酸羟化酶基因全长171kb，其中包含内含子12个，外显子13个，可编码翻译成451个氨基酸的多肽，经折叠聚合可形成有功能的苯丙氨酸羟化酶。一般认为,PKU是由于苯丙氨酸羟化酶基因突变引起PAH蛋白功能损坏或丧失而导致的,PAH基因中细微的改变都会引起酶蛋白三维结构的改变,并可造成PAH活性降低甚至完全丧失,导致在临床上产生PKU病患。绝大部分PAH缺乏或活性降低的病因在于PAH基因的点突变，PAH基因的点突变分布广泛，在12个内含子的上下游非编码区和13个外显子区域均有发现，不同点突变可造成不同程度的苯丙酮尿症临床表型，并且PAH基因具有突变异质性,不同种族与地区的突变位点及分布有较大差异。

目前检测基因点突变的方法有多种，如：溶解曲线法、特异性荧光探针法、测序法、芯片法。其中特异性荧光探针法是利用高特异性探针对目标序列进行检测，在检测单突变位点方面，特异性荧光探针法与其他方法相比具有特异性高、灵敏度高、时间短、操作简单、对检测设备要求不高的优点，但是高灵敏度特性导致该方法容易受到气溶胶的污染。目前临床上尚无使用特异性荧光探针法检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的试剂盒，而使用特异性荧光探针法准确检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的关键需要解决引物与探针的特异性和检测试剂的抗污染能力。因此，建立一套快速、准确、特异、灵敏、方便、稳定的分子检测方法，可以为PKU的研究提供快速高效的分子工具，在PKU的筛查、早期诊断与治疗方面具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确、特异、灵敏和/或方便地检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物、试剂和/或试剂盒；苯丙氨酸羟化酶基因突变检测方法、抗气溶胶干扰的方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物，所述组合物包括：611A上游引物、611G上游引物、611下游引物、728G上游引物、728A上游引物、728下游引物、1068C上游引物、1068A上游引物、1068下游引物、611探针、728探针和1068探针，其中：

所述611A上游引物是核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；

所述611G上游引物是核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；