[发明专利]一种M-MLV逆转录酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种M‑MLV逆转录酶及其制备方法。通过构建包含M‑MLV逆转录酶基因序列，将其连接到载体后导入大肠杆菌表达，基因突变体位点包含D524G、E562Q、D538N、G638H其中的一或多种。通过突变关键位点的氨基酸带电荷或疏水性的改变，从而改变M‑MLV逆转录酶的空间结构，减弱M‑MLV RNase H Minus，提高M‑MLV逆转录酶的活性和稳定性。

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，具体为一种逆转录酶，尤其是一种M-MLV逆转录酶及其制备方法。

背景技术

M-MLV转录酶具有极低RNase H的活性，在提高延伸能力的同时，保证了产物的稳定性，有利于下游实验的展开。M-MLV逆转录酶突变体，具有较高的延伸性、反应效率，同时支持高温反应。对于GC含量高或者具有二级结构的RNA模板也具有较好的兼容性。获得的cDNA若需保存，需进行分装后保存于-20℃或-80℃，避免反复冻融，且尽量在半年内使用。根据需要，可以选用Oligo dT、随机引物或者特异性引物作为逆转录引物，得到的cDNA可以用于后续的PCR、qPCR等实验。因此高活性和高稳定性的M-MLV逆转录酶具有重要的技术价值和商业价值。

但是，目前行业内的M-MLV逆转录酶在进行逆转录体系反应的时候活性不高、识别RNA模板的能力较弱，稳定性也不高，进行逆转录反应中的热稳定性差，逆转录反应的得到cDNA的产量也不高。所以如何构建和制备一种新型的M-MLV逆转录酶，使M-MLV逆转录酶的稳定性和活性提高，是本行业研究的热点和难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种M-MLV转录酶及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明内容提供了一种高稳定性的M-MLV逆转录酶的突变体，并给出了检测方法证实该突变体具体更高的活性和稳定性，可以用于ddPCR，达到代替商品酶的目的。

具体的说：

本发明通过提供一种以大肠杆菌重组的M-MLV逆转录酶野生型氨基酸序列(如SEQID NO.1)的基础上，设计突变体位置包含D524G、E562Q、D538N、G638H不局限于其中的一种或多种突变，通过突变关键位点的氨基酸改变氨基酸的带电荷或疏水性，从而改变M-MLV逆转录酶的空间结构，从而减弱M-MLV RNase H Minus，提高M-MLV逆转录酶的活性和稳定性。

通过PCR以及分子克隆技术改变碱基序列，实现氨基酸序列的改变。

另一方面，实现氨基酸突变的突变体M-MLV逆转录酶，与野生型的M-MLV逆转录酶相比，在37℃金属浴上保存65小时，加速实验发现，突变体的的活性和稳定性与商品酶保持一致。

本发明的包括以下步骤：

1)根据突变位点设计引物，在M-MLV逆转录酶野生型DNA序列(如SEQ ID NO.2)的基础上，通过PCR扩增将突变位点的DNA序列改变，并拼接处全长基因序列。

2)将拼接的全长基因序列XhoI和XbaI双酶切，通过T4连接酶克隆在pET-28a载体上。

3)连接产物转化DH5α感受态细胞中通过涂布卡那霉素抗性的平板培养。

4)通过PCR筛选阳性克隆。并通过测序验证突变体。

5)将筛选好的阳性克隆转化为NiCo21(DE3)E.coli感受态细胞(NEB#C2529)或SHuffle T7表达E.coli感受态细胞(NEB#C3029)感受态细胞，诱导表达。

6)大肠杆菌破碎诱导后的细胞，通过疏水层析色谱、亲和层析色谱和凝胶过滤层析色谱分离纯化目的蛋白。

7)对突变体活性进行检测。

8)通过37℃加热，测试突变体的稳定性。