[发明专利]一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途

说明书

本申请公开一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途，氧氟沙星抗原的合成包括：以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星与甘氨酸合成半抗原；以碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰为催化剂，半抗原与牛血清白蛋白偶联合成全抗原。合成的全抗原通过免疫小鼠、细胞融合、单克隆和无抗细胞培养技术成功研制出杂交瘤细胞株，其中一个细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C202112；该细胞株在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性抗氧氟沙星的单克隆抗体，该抗体对氧氟沙星反应灵敏度高且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。本申请的单克隆抗体可用于检测动物源性农产品中残留的氧氟沙星。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途。

背景技术

喹诺酮类(QuinoIones，QNs)是一类化学合成的抗菌药，多年来被广泛应用于养殖领域，其中的氧氟沙星曾经是人畜共用药。根据农业部2292号公告要求，为了人体健康和环境安全，从2016年12月30日后，停止在食用动物的养殖过程中使用氧氟沙星，因此，在动物源性农产品中不得检出氧氟沙星。从2017年以来，在动物源农产品中经常检出氧氟沙星，其中检出率最高的是恩诺沙星和氧氟沙星，但这2种药物的残留限量不同，前者是兽医专用药，在畜禽、水产品的肌肉中的限量为100μg·kg^-1(以恩诺沙星+环丙沙星计)；后者为不得检出。

目前，快检试剂盒开发存在的主要问题是抗氧氟沙星抗体特异性、灵敏度不够，而且抗体质量不稳定。喹诺酮类药物具有相同的母核结构，即不同品种的药物结构相似，以前开发的抗体对同类药物的交叉反应率较高，因此，需要开发一种对氧氟沙星反应灵敏度高，且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低的抗体。

发明内容

本申请合成一种氧氟沙星抗原，并通过免疫小鼠、细胞融合、单克隆和无抗细胞培养技术成功研制出杂交瘤细胞株，其在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性抗氧氟沙星的单克隆抗体，该抗体对氧氟沙星反应灵敏度高且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。

本申请提供一种氧氟沙星抗原的合成方法，包括：

以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)合成半抗原；

以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰为催化剂，所述半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成全抗原。

反应过程如下：

可选的，所述氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)的投料摩尔比为1：2～5(Oflx:Gly)。

进一步地，氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)合成半抗原的步骤包括为：

氧氟沙星(Oflx)与碳二亚胺混合，20～25℃反应10mins；然后加入甘氨酸(Gly)，继续在20～25℃反应30mins。

可选的，所述半抗原与牛血清白蛋白的投料摩尔比为20～60:1(Oflx:BSA)。

本申请还提供一种如所述合成方法合成得到的氧氟沙星抗原。

本申请还提供一种如所述氧氟沙星抗原在制备分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株中的用途。

本申请还提供一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括：

用所述的全抗原免疫BALB/c小鼠，再将免疫后小鼠的脾脏细胞与1581骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得分泌抗氧氟沙星抗体的杂交瘤细胞株。