[发明专利]一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用，通过设计得到的特异性引物组合探针组，实现了对14种非结核分枝杆菌的快速和准确的检测和鉴定，对引物组进行多重荧光PCR扩增得到的扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度，依据熔解温度能够快速准确的对14种非结核分枝杆菌进行检测。且本发明中的PCR‑HRM检测方法具有较高的检测通量，显著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间，此外，本发明中的PCR‑HRM检测方法还具有真实性高、准确性高、特异性强、灵敏度高以及抗干扰物能力强的优点，比临床一般要求的灵敏度敏感10‑20倍。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及了一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌(MTB)复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。非结核分枝杆菌主要包括鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈尔登分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、猿猴分枝杆菌(Mycobacterium.simiae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、玛尔摩分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)和亚洲分枝杆菌(Mycobacterium arisiense)。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身播散性疾病，具有较大的危害性。

NTM病与结核病具有相似的临床表现，包括全身中毒症状和局部损害症状。因此，在无菌种鉴定结果的情况下，NTM病常被误诊为结核病及支气管扩张等。NTM病因感染菌种、受累组织和器官的不同，其临床表现也不相同，临床上快速鉴别并区分NTM的具体种属存在一定的困难。

因此，开发一种快速检测且能够有效鉴别NTM具体种属的检测产品对于NTM的早期诊断和及时治疗具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用，本发明中的检测方法操作简单，可快速得到检测结果，且本发明中的检测方法采用两管检测试剂，一管试剂可以检测7种菌种，大大提高了检测通量，显著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间。且本发明中的检测方法具有较好的准确性和特异性，较高的敏感度以及较强的抗干扰物能力。

本发明的第一个方面，提供了一种检测非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM引物组，所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物组的核苷酸序列为：

NMT引物对：

NMT-F：5'-AGAAGACCGACGACGTBGC-3'(SEQ ID NO:1)；

NMT-R：5'-RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC-3'(SEQ ID NO:2)；

其中，NMT引物对可以靶向识别非结核分枝杆菌。

人源内标基因引物对：