[发明专利]一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法

权利要求书

1.一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法包括：

步骤一：检测试剂和材料准备，检测试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、反应液、阴性对照组和材料，引物组包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，引物组中各引物干粉1OD；反应液包括核酸反应液，核酸反应液包括具有链置换活性的DNA聚合酶、Buffer、dNTP、MgSO4、Betaine和荧光染料；阴性对照组包括不含目的基因反应液；材料包括未感染鸭细小病毒的鸭血清样本和鸭坦步苏病毒核酸样本；

步骤二：病毒DNA提取，使用病毒DNA提取试剂盒提取样本DNA；

步骤三：引物稀释，将试剂盒中引物1和引物2稀释成40uM,引物3和引物4稀释成5uM,引物5和6稀释成20uM；

步骤四：扩增反应体系，反应浓缩液15ul，引物组6ul,模板4ul和总反应体系25ul；

步骤五：扩增曲线和溶解曲线获得，将步骤四中的反应浓缩液、引物组、模板和总反应体系25混匀，放入定量PCR仪或恒温荧光基因扩增仪，设置65℃、30s/循环，60个循环或者65℃30分钟，通过FAM通道，每15S收集一次荧光信号，扩增结束后设置98℃-80℃的退火程序，间隔10-15秒收集一次荧光信号；可选循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线和基因快速检测系统中获得扩增曲线和溶解曲线；

步骤六：判定，根据步骤五所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。

2.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6具体为：

引物1：TGAACGCTCCGGTAGCTCTCTTGATTGGCACATTGAGATGG

引物2：AAAAGCACCACTTGAAAATGCCTCCAATGAAATAGTCTGTGGC

引物3：GAGCATCAAGCTTCAACTGT

引物4：TAATCTCCAGAACTGGGTCT

引物5：AGCCAGTGTTTTGCAGAGGT

引物6：CGAGCAGAATTGCTACTAACAA。

3.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述引物组设计根据鸭细小病毒特异性保守片段，使用Primer explorer软件设计引物组。

4.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述引物稀释过程中，稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)＝母液浓度(pmol/ul)×汲取母液的体积(ul)÷(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul)。

5.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述引物组中引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6对应目标序列8个特异区域。

6.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述基因快速检测系统中，64℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线。

7.根据权利要求1所述的一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，其特征在于，所述步骤六过程中，根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线不峰型单一判定为非特异性扩增；阴性质控品的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效。