[发明专利]定量多重扩增子测序系统

说明书

本发明公开了定量多重扩增子测序系统的方法，所述系统用于通过聚合酶链式反应用寡核苷酸条形码序列标记原始DNA样品，扩增用于高通量测序的基因组区域并定量DNA样品中的序列。所述方法允许分析包含1至10,000个靶区的DNA样品以用于定量潜在序列变体和野生型分子。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年11月2日提交的美国临时专利申请第63/108,649号的权益，该美国临时专利申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及分子生物学和生物信息学领域。更具体地，本公开涉及用于分析DNA样品以定量潜在序列变体和野生型分子的方法。

序列表的并入

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2021年10月7日，命名为P35008WO00_SL.txt，在Microsoft中测量的大小为24,576个字节。

背景技术

由于聚合酶链式反应(PCR)扩增期间聚合酶错误的存在和测序错误，检测具有低等位基因频率的DNA变体是困难的。尽管低频率突变，如癌症突变和病原体耐药性突变，具有重要的临床和生物学信息，但标准的下一代测序(NGS)无法自信地标识变异等位基因频率(VAF)低于大约2％至5％的变体。

在此，提供了用于将唯一分子标识符(UMI)附着到原始核酸分子以准确标识概率对数(LOD)低至0.1％的罕见突变的方法。还提供了一种基于阻断剂位移扩增(BDA)的方法，该方法在野生型分子上富集变体序列，以实现低深度测序的准确定量。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种用于分析包含至少一个针对潜在序列变体的靶区的DNA样品的方法，该方法包括：(a)使DNA样品与以下接触：(i)一组唯一分子标识符(UMI)引物，其中每个UMI引物包含UMI序列和与靶区子序列互补的基因特异性序列；(ii)第一DNA聚合酶；和(iii)DNA聚合酶延伸产生混合物所需的试剂和缓冲液；(b)使步骤(a)的混合物经受允许引物结合和DNA聚合酶延伸的一种或多种温度；(c)去除非延伸的UMI引物以产生产物；(d)将步骤(c)的产物与以下混合：(i)第二组DNA引物；(ii)第二DNA聚合酶；和(iii)聚合酶链式反应(PCR)所需的试剂和缓冲液，以及进行PCR以产生PCR产物；(e)对步骤(d)中产生的PCR产物进行高通量DNA测序，并且获得包含下一代测序(NGS)读段的序列文件；(f)标识反抑UMI序列，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个含有反抑UMI序列的NGS读段也包含该至少一个靶区的野生型序列；(g)从考虑中去除包含在步骤(f)中所标识的反抑UMI序列的所有NGS读段；和(h)基于步骤(g)中未去除的NGS读段的生物信息学分析，通过定量DNA变体分子来生成序列变体调用。

在一个方面，本公开提供了一种用于分析包含至少一个针对潜在序列变体的靶区的DNA样品的方法，该方法包括：(a)制备下一代测序(NGS)文库，其中将唯一分子标识符(UMI)序列添加到NGS文库中存在的多个多核苷酸中；(b)获得包括NGS读段的序列文件；(c)标识反抑UMI序列，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个含有反抑UMI序列的NGS读段也包含该至少一个靶区的野生型序列；(d)从考虑中去除包含在步骤(c)中所标识的反抑UMI序列的所有NGS读段；和(e)基于步骤(d)中未去除的NGS读段的生物信息学分析，通过定量DNA变体分子来生成序列变体调用。