[发明专利]定量多重扩增子测序系统

权利要求书

1.一种用于分析包含至少一个针对潜在序列变体的靶区的DNA样品的方法，所述方法包括：

(a)使所述DNA样品与以下接触：

(i)一组唯一分子标识符(UMI)引物，其中每个UMI引物包含UMI序列和与靶区子序列互补的基因特异性序列；

(ii)第一DNA聚合酶；以及

(iii)DNA聚合酶延伸产生混合物所需的试剂和缓冲液；

(b)使步骤(a)的所述混合物经受允许引物结合和DNA聚合酶延伸的一种或多种温度；

(c)去除非延伸的UMI引物以产生产物；

(d)将步骤(c)的所述产物与以下混合：

(i)第二组DNA引物；

(ii)第二DNA聚合酶；以及

(iii)聚合酶链式反应(PCR)所需的试剂和缓冲液，

以及进行PCR以产生PCR产物；

(e)对步骤(d)中产生的所述PCR产物进行高通量DNA测序，并且获得包含下一代测序(NGS)读段的序列文件；

(f)标识反抑UMI序列，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个含有所述反抑UMI序列的NGS读段也包含所述至少一个靶区的野生型序列；

(g)从考虑中去除包含在步骤(f)中所标识的所述反抑UMI序列的所有NGS读段；以及

(h)基于步骤(g)中未去除的所述NGS读段的生物信息学分析，通过定量DNA变体分子来生成序列变体调用。

2.一种用于分析包含至少一个针对潜在序列变体的靶区的DNA样品的方法，所述方法包括：

(a)使所述DNA样品与以下接触：

(i)一组唯一分子标识符(UMI)引物，其中每个UMI引物包含UMI序列和与靶区子序列互补的基因特异性序列；

(ii)第一DNA聚合酶；以及

(iii)DNA聚合酶延伸产生混合物所需的试剂和缓冲液；

(b)使步骤(a)的所述混合物经受允许引物结合和DNA聚合酶延伸的温度；

(c)去除非延伸的UMI引物以产生产物；

(d)将(c)的所述产物与以下混合：

(i)第二组DNA引物；

(ii)第二DNA聚合酶；以及

(iii)聚合酶链式反应(PCR)所需的试剂和缓冲液，

以及进行PCR以产生PCR产物；

(e)对步骤(d)中产生的所述PCR产物进行高通量DNA测序，并且获得包含下一代测序(NGS)读段的序列文件；

(f)将所述NGS读段分组为至少一个UMI家族，其中在UMI家族内的每个NGS读段包含同一UMI序列并与相同的扩增子比对；

(g)对于每个扩增子，从考虑中去除低于阈值的UMI家族中的所有NGS读段，其中所述低于阈值的UMI家族具有小于X的大小，其中X是所述扩增子的最大Z UMI家族大小的平均值的Y％，其中Y介于1％和20％之间，并且其中Z介于1和20之间；以及

(h)基于步骤(g)中未去除的所述NGS读段的生物信息学分析生成序列变体调用。