[发明专利]精确和可编程的DNA切刻系统和方法

说明书

切刻分子切刻或切割易位通过实时单碱基读取纳米孔测序装置的多核苷酸分子，所述实时单碱基读取纳米孔测序装置通过探测所述多核苷酸分子的个别碱基实现实时单碱基读取测序。引导所述多核苷酸分子进入并且易位通过所述纳米孔测序装置的纳米孔。确定切口或分裂的靶序列，并且通过所述纳米孔测序装置对所述多核苷酸分子进行测序。在读取所述靶序列之后，施加外部激发以触发一个或多个切刻分子，并且从而在邻近所述一个或多个切刻分子的位置处切刻或切割所述多核苷酸。在需要进一步切割或切割相同靶序列的情况下，继续过程，并且在需要切割或切割另一靶序列的情况下，确定另一靶序列。

技术领域

所公开的技术涉及用于切刻多核苷酸的方法和设备，并且更具体地，涉及通过单碱基分辨率的实时测序(下文称为“单碱基读取”)和分子切刻动作的协同组合的精确和可编程的多核苷酸切刻。

背景技术

在基因组学和生物工程中，切刻或切割是大多数核酸体内和体外操作的关键步骤，如过多的分子马达一直沿着活细胞的染色体有力地工作所显示的。内切核酸酶是通过分离多核苷酸的核苷酸而切割多核苷酸链的酶。限制性内切核酸酶(RE)是重要的分子工具之一，其主要通过生成切口或分裂来操作双链DNA。自从Watson和Crick在1953中发现DNA双螺旋结构以来，已经发现了多种类型的RE。RE可以根据它们的结构、特异识别序列、催化活性和切刻或切割位置和分子进行分类。不同的RE用于核酸操作、分析和样本制备的应用中，其包括克隆、多态性研究、甲基化剖析、基因表达分析和高通量DNA测序的优化。

RE由识别结构域和切割结构域组成。前者识别并且结合特异核苷酸序列，称为识别序列。识别序列通常具有4至8个碱基。在该识别序列与识别结构域结合后，根据所使用的RE的类型，切割结构域在识别序列上、靠近或远离识别序列施加不同的切刻或切割动作。由于RE的结合动作是序列特异的，切刻或切割位置取决于识别序列的存在(不管该位置在该序列识别后的精确位置在哪里)。此类序列特异性限制了沿着DNA切刻或切割的位点数量。DNA在特定目的测序后的任何点都不会被切刻，因为切刻动作严格偶联到RE的特异序列识别。

如果想要在沿着相同DNA的不同位点，即不同识别序列之后的位点切刻或切割，则需要多个RE来识别每个目的识别序列。使用多个RE可能不利地复杂化或干扰酶的准确性和精确性。例如，众所周知，RE BamHI在次优缓冲条件下表现出非特异动作。如果使用需要不兼容的不同条件来保持活性的不同RE，则情况会更糟。

如果切刻或切割动作可以随意实现(即，在任何期望的多核苷酸序列处或附近)，而不限于任何特异识别序列，核酸工程和操作的范围可以大大拓宽。可以探索和开发更多新颖的应用。例如，通过拓扑修改制造DNA穿孔卡片可以实现基于DNA的数据存储。

为了检测期望的多核苷酸序列，需要准确的测序。用于测序多核苷酸的一类技术是基于纳米孔的测序技术。纳米孔可以大致分类为两种类型：生物的和固态的。这两种类型都已被使用并且证明适用于测序。通常将生物纳米孔，即称为跨膜蛋白通道，插入平面底物，诸如脂质双层或脂质体，中以形成传感平台。实例是α-溶血素、MspA和噬菌体phi29。固态纳米孔是指由无机材料诸如氧化物(例如Al₂O₃、SiO₂)、氮化物(例如Si₃N₄)、2D材料(例如石墨烯、MoS₂)、聚合物制成的那些。固态纳米孔通常通过物理过程制造，例如离子或电子束轰击、电化学蚀刻、离子跟踪蚀刻。