[发明专利]从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用，大肠杆菌工程菌构建了由丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因融合表达构成的聚乳酸合成途径而获得。本发明并能够实现在生物体内以乙酰辅酶A为起始代谢物向聚乳酸的转化。本发明提供的突变体菌株内表达本发明提供的编码组成聚乳酸合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本发明所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成16％细胞干重。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从乳酸合成纯聚乳酸大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

聚乳酸(PLA)为一种聚合物。在传统工业中主要用于医药、纤维制品、可降解塑料、农业生产等领域。聚乳酸作为一种由植物作为原料经过微生物发酵以及化学合成所生产的新型可降解材料，具有良好的机械性能和优良的物理性能，可以以简单的加工方式，如吹塑、热塑使其成为各种各样的塑料制品。随着当今社会日益增长的环保需求，其在替代传统塑料应用方面有着卓越的前景。

目前聚乳酸的生产主要是基于乳酸为原料通过熔融聚合或直接缩聚的化工路线。化学合成法工艺常需高温高压并且需要化学催化剂，具有高能耗高物耗和化学残留的问题，合成成本和环境损害极高。

近年来，现有技术通过对聚羟基脂肪酸合成的研究，找到了对乳酸有特异活性的合成酶，该途径起始于乙酰辅酶A，经过乳酰辅酶A合成聚乳酸。首先，一分子的乙酰辅酶A和一分子D-乳酸在丙酰辅酶A转移酶(Pct)的催化下生成一分子D-乳酰辅酶A和一分子醋酸盐。之后，生成的乳酰辅酶A在PhaC合成酶(PhaC)的作用下聚合产生聚乳酸。该途径已被构建于用于合成3-羟基丁酸和乳酸的聚合物p(3HB-co-LA)。但Pha合成酶对于乳酸的特异性低，导致聚乳酸的产量和分子量很低。此外，该途径只能合成R构型的短羟基辅酶A((R)-HA-CoA)，即只能合成右旋聚乳酸(PDLA)，人体内分解出的D-乳酸无法被代谢而产生毒性，因此限制了应用方向。

发明内容

发明目的：本发明提供一种从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌。

本发明的另一目的是提供所述从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌的制备方法及应用。

本发明的环境友好型可再生的聚乳酸合成途径，引入大肠杆菌，通过丙酰辅酶A转移酶突变体基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶突变体基因融合表达构成聚乳酸合成途径在胞内合成聚乳酸来达到可再生塑料的目的。

技术方案：本发明的从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌构建了由丙酰辅酶A转移酶基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因融合表达构成的聚乳酸合成途径。

其中，所述编码丙酰辅酶A转移酶的基因为来自丙酸梭菌Clostridiumpropionicum的突变体，编码聚羟基脂肪酸酯合成酶的基因为来自食树脂假单孢菌Pseudomonas resinovorans的突变体。

其中，所述的融合基因，其特征在于，所述的融合蛋白由Pct(AEF)、一个连接短肽(L)和PhaC(DDDTSGK)组合而成，由Pct(AEF)-L-PhaC(DDDTSGK)或PhaC(DDDTSGK)-L-Pct(AEF)表示。

其中，本发明所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的醇醛脱氢酶的编码基因adhE获得。

其中，本发明所述宿主大肠杆菌包括Escherichia coli BL21、MG1655、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。

其中，本发明所述聚乳酸合成途径中编码该途径中所有基因的载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体中的一种或几种。