[发明专利]一种融合蛋白及其制备司美格鲁肽中间体多肽的方法

说明书

本发明公开了一种融合蛋白及其制备司美格鲁肽中间体多肽的方法，属于基因工程及多肽制备技术领域。所述融合蛋白包括一段融合肽，蛋白酶酶切位点和目的主分子序列。通过优化融合肽序列，改变蛋白等电点及亲水性等性质，有效提高了融合蛋白的表达量，最高可达13.1g/L；同时，也改善了融合蛋白的性状，利于后续提取、酶切及纯化工艺的开发，酶切后中间体多肽的量为3.62g/L。从源头降低了司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP‑1(9‑37)的生产成本，有利于工业化放大，适用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其制备司美格鲁肽中间体多肽的方法，具体涉及一种可高效制备司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的融合蛋白序列，属于基因工程及多肽制备技术领域。

背景技术

2型糖尿病(T2DM)是由多种病因造成人体胰岛β细胞功能受损、胰岛素分泌不足或者靶组织的胰岛素抵抗力增强引起的慢性代谢性紊乱综合症，临床上主要表现为多饮、多食、多尿及体重减轻等症状，并具有突发糖尿酮症酸中毒、高渗性昏迷等并发症的风险。T2DM是一种慢性代谢疾病，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。目前，临床上治疗糖尿病的药物主要集中在各类胰岛素和四大类口服降糖药。为了让糖尿病患者在治疗时有更多的选择，一些新型的治疗糖尿病药物在21世纪初应运而生，如胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，这类药物是在内源GLP-1的基础上经过结构改变而成的。内源性的GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种肠促降糖激素，含有30多个氨基酸，能通过广泛分布人体心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胃肠道等多器官组织的细胞膜表面的GLP-1受体结合，引发细胞内部相关信号传导路径发生改变，从而发挥相应的调节机体的功能，所以GLP-1具有多功能、多靶点的作用特点，尤其对胰岛细胞的调节功能尤为显著，能根据体内葡萄糖水平按需促进胰岛素分泌。但唯一的不足是GLP-1在人体内很容易被二肽基肽酶IV降解，半衰期大约2min，这就限制了其临床运用。结构改造后的GLP-1制剂既保留了GLP-1的药理作用，又大大提高了药物的作用时间。

司美格鲁肽(Semaglutide)是由Nove Nordisk公司研发的长效GLP-1类似物，通过基因重组技术，利用酵母生产获得，该药物只需要进行每周一次的皮下注射给药。司美格鲁肽作为GLP-1类似物的代表药物之一，在多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。

司美格鲁肽的主链结构为一个含有29个氨基酸的中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)或含有27个氨基酸的中间体多肽Arg34GLP-1(11-37)，其氨基酸序列分别为EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(SEQ ID NO:1)和TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(SEQID NO:2)。目前现有技术中该中间体多肽主要通过化学合成的方法制备(公开号为CN105753964A的专利文献，公开于2016年)，但是化学法工艺步骤多，合成过程中需要使用多种的有机溶剂且使用量较大，不利于工业化放大且对环境不友好，且化学合成多肽中潜在的氨基酸消旋体杂质给该药的长期使用带来一定风险。而其他生物法制备该中间体多肽的方法包括胞内可溶性表达、包涵体表达以及包涵体形式的串联表达。其中，胞内可溶性表达(公开号为CN104745597A的专利文献，公开于2015年)的表达量较低，不具备工业化放大价值；涉及包涵体表达的专利CN110498849A(公开于2019年)公开了一种高纯度和高收率的制备司美格鲁肽主肽链的方法，但是其中公开的优选前导肽序列KPSTYI属于短肽序列，无法有效提高融合蛋白的表达量；另外，在专利公开号为CN111378027A(公开于2020年)的专利文献中针对司美格鲁肽的中间体多肽进行了串联表达，利用KexII蛋白酶酶切位点KR作为linker，需要经过KexII酶以及羧肽酶B两步酶切得到司美格鲁肽的中间体多肽，步骤繁琐且KexII酶价格昂贵，不具备工业化放大意义。

基于现有技术存在上述技术问题，因此迫切需要寻找一种融合蛋白表达量更高、工艺步骤更简单、更适合工业化生产的方法。

发明内容