[发明专利]一种融合蛋白及其制备司美格鲁肽中间体多肽的方法

权利要求书

1.一种融合肽，其特征在于，所述的融合肽序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含权利要求1所述的融合肽，所述融合蛋白为融合肽-DDDDK-Arg34GLP-1(9-37)或融合肽-DDDDK-Arg34GLP-1(11-37)；

所述Arg34GLP-1(9-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Arg34GLP-1(11-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.编码权利要求2所述融合蛋白的基因。

4.一种重组表达载体，其特征在于：含有权利要求3所述基因。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K或pTrc系列载体；所述pET系列载体为pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)；所述Duet系列载体为pRSFDuet-1、pCDFDuet-1；所述pTrc系列载体为pTrc99a。

6.表达权利要求2所述融合蛋白或含有权利要求3所述基因的重组微生物细胞。

7.根据权利要求6所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞的宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母；所述大肠杆菌为大肠杆菌JM109(DE3)、大肠杆菌HMS174(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rostta2(DE3)、大肠杆菌Rosttagami(DE3)、大肠杆菌Rostta2(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌W3110和/或大肠杆菌K12。

8.制备司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的方法，其特征在于，利用权利要求6或7所述重组微生物细胞发酵生产司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将所述重组微生物细胞在35～40℃下培养10～12h，得到种子液，然后按照0.1％～2％(v/v)的接种量接入TB培养基中培养至发酵液OD₆₀₀值达到6～8时，加入终浓度为0.05～1mM的IPTG进行诱导，在25～40℃下诱导14～18h后结束发酵，将发酵后的菌体破碎并提取、酶切得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：将所述重组微生物细胞在LB培养基中35～40℃下培养8～12h，得到细胞种子液，将细胞种子液接入基础发酵培养基进一步培养8～12h得到二级种子液，然后接入含有基础发酵培养基中进行培养；当发酵液OD₆₀₀的值达到100～200时，加入终浓度为0.05～1mM的IPTG进行诱导，在25～40℃下诱导8～18h后结束发酵，收集菌体，将菌体破碎并提取、酶切得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)。

11.根据权利要求9或10的方法，其特征在于，将菌体破碎后离心收集得到包涵体沉淀，将包涵体利用洗涤缓冲液进行洗涤，将洗涤后的包涵体在pH为6.0～10.0的条件下，按照蛋白浓度为5～55g/L加入包涵体溶解缓冲液，进行溶解，将溶解后的融合蛋白经肠激酶在30～35℃下酶解20～24h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液，将混合液分离后即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品。

12.权利要求1所述融合肽，或权利要求2所述融合蛋白，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组表达载体，或权利要求6或7所述微生物细胞在制备司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)中的应用。