[发明专利]一种人源细胞制剂静脉输入动物体内脏器组织分布的检测方法

权利要求书

1.一种检测人源细胞的方法，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示片段为模板，设计特异性引物，采用RT-qPCR法检测；

优选地，所述方法检测的是动物体、动物组织或动物细胞培养物中的人源细胞的分布；更优选地，所述方法检测的是人源细胞制剂静脉输入实验性动物体内脏器组织或血液分布；

优选地，所述特异性引物为：

forward：5′-CCATCCTCCGTGAAATCAAT-3′(SEQ ID NO.2)

reverse：5′-GGGAACGTGTGGGCTATTTA-3′(SEQ ID NO.3)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)根据NCBI-Genome中所提供的人类和大鼠基因组，经过比对获得差异最大一部分序列，所述序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以获得的这段序列为模板，设计出人源细胞线粒体DNA特异性的引物A和大鼠DNA内参基因特异性引物；

2)提取人源细胞制剂细胞和大鼠脏器组织或血液DNA，分别进行梯度稀释，并指定梯度稀释的DNA起始浓度的相对百分比浓度为100％，利用实时定量RT-qPCR，分别建立人源细胞线粒体DNA特异性引物A和大鼠内参基因特异性引物的RT-qPCR扩增的标准曲线，所述标准曲线的X轴为各类DNA的相对百分比浓度，Y轴为各相对百分比浓度的DNA经引物A或大鼠内参基因特异性引物扩增获得的Ct值；

3)人源细胞制剂给予大鼠之后，按照需要观察的时间点采集大鼠脏器组织、血液，提取样本总DNA进行RT-qPCR反应，得到引物A和大鼠内参基因引物扩增的Ct值；

4)利用步骤(2)标准曲线，分别获得各脏器组织或血液总DNA样本中引物A和大鼠内参基因引物扩增的DNA模板的相对百分比浓度，将人源细胞线粒体DNA特异性引物A扩增的DNA模板的相对百分比浓度除以大鼠内参基因特异性引物扩增的DNA模板的相对百分比浓度，获得的比值对大鼠脏器组织或血液中人源DNA含量进行表征；

优选地，所述步骤(2)包括：

将一定量的人源细胞DNA和大鼠DNA分别按2-20倍梯度稀释后，分别进行RT-qPCR；优选5-15倍梯度稀释；更优选10倍梯度稀释；根据反应体系所产生的循环数Ct值，绘制DNA的相对百分比浓度-Ct值的标准曲线，即分别建立引物A和大鼠内参基因引物的RT-qPCR扩增的标准曲线。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，人源细胞制剂给予大鼠后，利用DNA提取试剂盒提取各脏器组织及全血总DNA，提取的样本总DNA进行RT-qPCR反应；所述各脏器组织包括心、肝、脾、肺、肾；所述的人源细胞制剂包括体细胞(如上皮细胞)、体外诱导形成的多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝干细胞、表皮干细胞、视网膜干细胞等，优选为人间充质干细胞，更优选为人脐带间充质干细胞；RT-qPCR反应条件与标准曲线建立反应条件相同。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠内参基因为GAPDH，GAPDH引物序列如下:

forward：5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′(SEQ ID NO.4)

reverse：5′-GCCAGTAGACTCCACGACA-3′(SEQ ID NO.5)。

5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，配制浓度为25ng/μL的人源细胞DNA或大鼠DNA，以25ng/μL作为梯度稀释的DNA起始浓度，其DNA的相对百分比浓度为100％，依次稀释2倍、20倍、200倍、2000倍、20000倍和200000倍，即得到相对百分比浓度分别为50％、5％、0.5％、0.05％、0.005％、0.0005％的DNA梯度稀释样品，各取1μL进行RT-qPCR，每个浓度设3个复孔，以Ct均值为Y轴，以人源细胞DNA的相对百分比浓度为X轴，建立人源细胞线粒体DNA特异性引物Homo1的标准曲线；按照同样的方法建立大鼠内参基因GAPDH的标准曲线。