[发明专利]一种Tn5转座酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种Tn5转座酶及其制备方法。通过构建包含Tn5转座酶基因、内含肽基因、几丁质基因的全长目的基因序列，将其连接到载体后导入大肠杆菌表达，采用一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，得到的纯化Tn5转座酶，可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列，而且无序列偏向性选择。

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，具体为一种转座酶，尤其是一种Tn5转座酶及其制备方法。

背景技术

Tn5转座子可在体外插入到含有靶DNA的载体上，在没有镁离子孵育时，Tn5转座子能够形成稳定的Tn5转座体复合体，可以通过电击进入活细胞，转座体经细胞内镁离子活化后，就能随机插入到宿主的基因组DNA中。

Tn5转座酶识别Tn5转座子序列的内端(inside end，IE)、外端(outside end，OE)和嵌合端(mosaic end，ME)序列，含有ME序列片段的体外转座效率最高。Tn5转座子的插入位点具有很高的随机性，因此被广泛的用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)和二代测序建库等领域。

但是，目前行业内的Tn5转座酶普遍在打断DNA序列时，有序列偏向性，且稳定性不高。所以如何构建和制备一种新型的Tn5转座酶突变体，使Tn5转座酶在插入DNA序列时，无序列偏向性选择，而且稳定性更高，是本行业研究的热点和难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Tn5转座酶及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

Tn5转座酶的酶活单位定义：1单位Tn5转座酶指37℃条件下反应1小时，完全切割1ug含有识别序列的DNA片段所需要的酶量。

一种Tn5转座酶，表达基因包括Tn5转座酶基因、内含肽基因和几丁质基因。

优选的，所述表达基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述表达基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过构建包含Tn5转座酶基因、内含肽基因、几丁质基因的全长目的基因序列，将其连接到载体后导入大肠杆菌表达，采用一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，得到的纯化Tn5转座酶，可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列。

新型的蛋白融合表达及纯化系统(IMPACT)，IMPACT表达的目的蛋白与内含肽(intein)及几丁质结合蛋白(CBD)形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白，DTT诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目的蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的，该方法具备比以往的亲和层析纯化方法更加经济的特点，方法更加新颖，可提高目的蛋白表达的成功率。

具体制备过程如下：

1、构建载体，种子培养，得到含目的基因的质粒；2、诱导表达：将目的基因的质粒转入大肠杆菌中表达；3、菌体富集处理，破碎大肠杆菌，得到粗酶裂解液；4、疏水层析，去除疏水性差异大的杂质；5、几丁质(Chitin)亲和层析，捕获Tn5、几丁质、内含肽的融合蛋白；6、采用DTT切断内含肽，剔除几丁质标签，得到粗的Tn5转座酶；7、采用离子交换层析对Tn5进行精纯；8、采用凝胶过滤层析将Tn5转座酶置换到保存液中；9、通过超滤浓缩得到高纯度高浓度的Tn5转座酶。

优选的，所述质粒载体为pET-28a，所述RBS如SEQ ID NO.3所示。

本发明的制备原理如下：

1)按照SEQ ID NO.1合成全长基因序列

2)将拼接的全长基因序列Xho I和Xba I双酶切，通过T4连接酶克隆在pET-28a载体上。

3)连接产物转化DH5α感受态细胞中通过涂布硫酸卡那霉素抗性的平板培养。