[发明专利]一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用。将从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中克隆得到的麦角硫因合成基因egt1、egt2导入并整合到圆红冬孢酵母菌基因组中，筛选得到高产麦角硫因菌株。与出发菌株相比，该重组菌株5L发酵罐发酵麦角硫因产量比原始菌株提高270.2％，达到8.5g/L左右，为圆红冬孢酵母菌株工业化生产麦角硫因奠定了良好的基础。同时发酵周期较短，发酵产物中没有毒副作用的产物，且圆红酵母代谢途径改造难度较小，可操作性更强。

技术领域

本发明涉及基因重组领域，尤其涉及一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine,EGT)最早由Tamcet于1909年从麦角菌(Clavicepspurpurea)中分离得到的一种稀有天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，又叫2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐。多存在于动植物体内却不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄入并吸收、积累、保存于机体内。同时EGT作为机体内的一种重要活性物质，具有清除自由基、帮助机体解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长以及细胞免疫等多种生理作用，因而也被认为是一种特有的、多功能的细胞生理保护剂。在食品、化妆品、医药等领域应用前景广阔。

当前麦角硫因主要通过化学合成、组织提取以及生物发酵合成等方法来获取，化学合成法由于左旋麦角硫因合成困难，原料昂贵，难以达到预期的产量；提取法主要通过培养和提取如担子菌纲等生物质以获取麦角硫因，但有着生产率低、原料来源不足、培养周期长、提取方法复杂等问题；随着分子生物学及代谢工程等生物科学技术的快速发展，生物发酵合成法生产麦角硫因成为最具有潜力的生产方法。

麦角硫因生物合成途径大致可分为两种，一种是在细菌中由EgtABCDE基因簇编码的5个酶进行连续催化合成的途径；另一种是在真菌中由Egtl、Egt2两个酶催化的合成途径。生物发酵合成的改造多集中于通过基因工程手段强化参与EGT合成的关键基因表达，来获得生产能力显著提升的EGT工程菌株。再通过模式菌株高密度发酵，异源表达EGT合成所需的关键酶基因，再发酵生产EGT。例如Osawa R等将耻垢分枝杆菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达，将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高EGT产量，摇瓶发酵EGT产量达到24mg/L；在此基础上，Tanaka N等对半胱氨酸进行过表达，进行发酵罐培养，持续性补加组氨酸等前体物质，发酵216h最终获得1.3g/L EGT，这是目前利用大肠杆菌发酵生产EGT的最高产量的方法，但是，以大肠杆菌作为出发菌株，会产生内毒素，对后续产品的提纯有很大影响。Takusagawa S等通过在米曲霉(Aspergillus oryzae)中强化表达粗糙脉孢菌来源的egt1和egt2基因，将米曲霉宿主的EGT产量提升至231mg/L的水平，但是，米曲霉的发酵周期长达10天以上，麦角硫因产量低，且后续对其代谢途径的改造难度大。Steven A等利用酿酒酵母，通过异源表达麦角菌、耻垢分枝杆菌等多个来源的EGT合成酶基因(egtA、egtB、egtC、egtD、egtE)，在1L发酵罐流加分批发酵的条件下，经84h培养获得了0.598g/L的EGT产量，但在上罐放大测试中，菌株出现了明显的生长抑制和提前死亡现象，产量没有提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改造难度较小，产量高的高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组菌株。

为实现上述目的，本发明提供一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株，其特征在于，含有麦角硫因合成基因egt1和egt2，所述egt1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，所述egt2的核苷酸序列为SEQ ID NO:9；菌株是圆红冬孢酵母菌。

进一步，制备方法包括，

S1，构建egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2；