[发明专利]一种检测新冠病毒核酸的多重荧光定量PCR方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测新冠病毒核酸的多重荧光定量PCR方法。本发明技术体系由分别针对新冠病毒ORF1ab和N基因的两对引物探针组成，其中每对引物探针由上游引物、下游引物和TaqMan探针组成。其中靶向新冠病毒ORF1ab基因的引物探针匹配病毒基因组nt–nt区域，靶向新冠病毒N基因的引物探针匹配病毒基因组nt–nt区域。两套引物探针组成多重荧光定量PCR方法，并设阳性对照和阴性对照。以荧光定量PCR扩增曲线为检测结果判别依据，当阳性对照扩增曲线为阳性且阴性对照无典型扩增曲线时，同板检测的实验结果可信。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测新冠病毒核酸的多重荧光定量PCR方法。

背景技术

qRT-PCR(荧光定量逆转录PCR)方法是新冠病毒核酸检测的常用方法，具有灵敏度高、特异性好、检测通量大和便于大规模装备等优势[1]。多重 qRT-PCR方法利用多种荧光标记不同TaqMan探针，可在同一反应管内同时检测多个靶标[2]。qRT-PCR方法检测新冠病毒核酸的效果受多种因素影响，包括引物和TaqMan探针性能、试剂和耗材质量、检测设备、操作人员和环境条件等。其中引物和探针的性能病毒核酸检测效果的主要影响因素[3]。由于病毒基因组的复杂二级结构及GC含量差异，使得仅有有限区域可用于设计检测引物探针。选择病毒基因组的哪个区段设计引物探针，并据此进行方法学优化是建立病毒核酸检测qRT-PCR方法的核心所在。不同单位研发的新冠病毒核酸检测 qRT-PCR产品的性能差异的原因大都源自引物探针序列的优劣。

无症状感染已成为新冠病毒流行传播的重要特征，表现为感染后无明显临床症状、病毒载量低，需连续多次检测才能发现病毒感染[4]。新冠病毒核酸检测方法的性能优劣直接影响疫情防控效果，因此亟需研发灵敏度更高、性能更优的新冠病毒核酸检测试剂。

参考文献：

[1]Wang HL,Li G,Zhao J,Li YJ,Ai YS.An Overview ofNucleic Acid Testingforthe Novel Coronavirus SARS-CoV-2.FrontMed(Lausanne),2020,7:571709.

[2]Perchetti GA,Nalla AK,Huang ML,Jerome KR,Greninger AL.Multiplexing primer/probe sets for detection of SARS-CoV-2by qRT-PCR.J ClinVirol,2020,129:1044499.

[3]Zhou Y,Zhang L,Xie YH,Wu J.Advancements in detection of SARS-CoV-2infection for confronting COVID-19pandemics.Lab Invest,2021,DOI: 10.1038/s41374-021-00663-w.

[4]Oran DP,Topol EJ.The Proportion of SARS-CoV-2Infections That AreAsymptomatic.Ann Intern Med,2021,174(5):655-662.

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种检测新冠病毒核酸的多重荧光定量PCR方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

采用TaqMan探针法、qRT-PCR方法，基于新冠病毒基因组保守区域设计优化检测引物和探针序列，优化组合为多重qRT-PCR方法，通过病毒核酸提取 -qRT-PCR在96孔或384孔反应板，借助TaqMan探针敏感度高的特点，实现对新冠病毒核酸的高灵敏度、高通量和低成本检测。