[发明专利]一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法

说明书

本发明公开了一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，包括以下步骤：先将原始pTargetF质粒改造为包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter‑N20‑gRNA scaffold结构质粒，同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列，得到pTargetT；在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后，使用阿拉伯糖诱导表达λ‑Red重组酶，随后转入pTargetT编辑质粒，培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。本发明克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷的同时能保证乳糖作为发酵底物的充分吸收，提高乳糖在发酵过程中的利用率，本方法适用不同lac操纵子的大肠杆菌改造，增加本底菌株的可选项，节省构建菌株时的成本。

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法。

背景技术

lac操纵子是大肠杆菌组最常见的表达调控单位，可使细胞摄入并代谢β-半乳糖苷类糖，如乳糖。其中三个代谢基因包括编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的lacZ基因，编码β-半乳糖苷通透酶(permease)的lacY基因以及编码β-半乳糖苷转乙酰基酶(transacetylase)的lacA。此外还包括了表达阻遏物（Lac repressor）的不可调控基因lacI。lac操纵子的转录调控对于诱导物的应答十分迅速，在不含β-半乳糖苷的条件下，每个细胞约含5个分子β-半乳糖苷酶，在加入适宜底物时，2-3min该酶即可表现出活性并且后续很快达到约5000个分子水平，并且β-半乳糖苷酶的量最高可达总可溶性蛋白的5%-10%，若除去底物，该酶的合成会立即停止。正是由于此特性，此结构往往被用于质粒改造或基因编辑，并使用不可降解的IPTG作为诱导底物控制目的基因的表达。

乳糖作为重要生命反应的重要成分，其代谢过程研究得较为清晰，具有成熟的工业生产工艺。目前，乳糖被广泛应用于食品与生化研究，在工业发酵方面具有广泛的应用前景。lac操纵子具备代谢乳糖的能力，如果以乳糖为底物进行生物合成就必须要限制细胞本身的乳糖代谢能力。目前大肠杆菌有lacZΔM15基因突变型限制自身乳糖代谢，此种突变是lacZ基因是通过缺失编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的片段，导致表达产物ω片段不具备酶学活性，如JM109系列、DH5α、TOP10等。该突变可通过携带编码α片段基因的lac操纵子通过载体DNA（如pUC19 DNA）补全得到具备活性的β-半乳糖苷酶，常用作菌株蓝白斑筛选。

如果选择以JM109系列等lacZ缺陷型的菌株作为本底菌株，首先会受到菌株选择的限制；其次lacZΔM15基因型的菌株，在诱导后由于启动子高效响应所产生大量缺陷的β-半乳糖苷酶分子会浪费细胞的许多资源和能量，这对发酵过程中细菌生长及产物收益会产生不利影响；此外lacZΔM15基因型所表达出的缺陷β-半乳糖苷酶分子仍具有约正常功能3%活性，这就使得细菌自身仍具备代谢少量乳糖的能力，在长时间的发酵过程中会降低底物的转化率。

大肠杆菌的许多株系均可用于工业生物合成，其中就有无缺陷lac操纵子的菌株如BL21系列等，由于可自身代谢乳糖,必须经过改造后才能使用。这就使它们在作为发酵本底菌株时必须经过比lacZΔM15基因型菌株更多的改造步骤才能发挥菌株效果，无疑增加了研发成本。