[发明专利]一种陈氏刺棘虫的检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测环境和鱼体中陈氏刺棘虫的检测试剂盒及检测方法，属于寄生虫病原体检测技术领域。本发明还公开了检测陈氏刺棘虫的实时荧光定量PCR引物，可快速检测养殖水体和鱼体中的陈氏刺棘虫的幼虫和成虫，大大提高了检测效率，节约了检测时间及检测成本。本发明特异性强，对养殖水体环境DNA没有非特异性扩增，灵敏度高，高达10copies/μL。

技术领域

本发明涉及鱼类寄生虫病原体的检测领域，涉及一种鱼类致病菌检测试剂盒，尤其涉及一种陈氏刺棘虫的检测试剂盒及其应用。

背景技术

刺棘虫属(Acanthosentis)是棘头动物门、始新棘头虫纲、圆棘头虫目、四环科的一属，主要寄生于鱼类，可给水产养殖业带来重大经济损失。刺棘虫可感染多种鱼类，包括鳗鲡、瓦氏黄颡鱼、南方马口鱼、鲈、红鳍鲌、鰶、刀鲚、鲢、鳙、鲫等。在我国目前报道较多的刺棘虫为陈氏刺棘虫(Acanthosentis cheni)，其生活史中陈氏刺棘虫需要利用节肢动物作为中间宿主，如水环境中的蚤类等都可能成为其中间宿主。寄生虫的成虫主要寄生在鱼类的幽门盲囊，幼鱼感染可引起大面积死亡，成鱼感染可引起其肠道微生物结构发生变化，造成特定微生物物种组成的变化，引起鱼类免疫力下降，降低其抵御病原菌感染的能力，给水产养殖带来危害。

目前我国检查陈氏刺棘虫主要通过显微镜镜检虫体及虫卵形态学，这些方法都存在对检测样本要求严格(必须获得成熟雄虫并对其粘液腺进行观察)、敏感性低、假阳性等问题，利用显微镜检查水环境样本中的刺棘虫幼虫更是费时费力且准确性极低。

为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养殖水体中是否存在寄生虫的技术，因此提供一种同时检测三种刺棘虫的多重实时荧光定量PCR引物和探针及配套试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了引物组合、引物对、检测陈氏刺棘虫的试剂盒，该引物对的灵敏度可达10copies/μL，该检测试剂盒是以待检样品中陈氏刺棘虫COX2基因为检测对象，准确度及精密度均较好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：引物组合，所述引物组合具有：

(I)上游引物具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；和

(II)、下游引物具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；或

(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(IV)、与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

本发明内容还包括引物对，所述引物对包括上游引物ACCOX2-I-F和下游引物ACCOX2-I-R；所述上游引物ACCOX2-I-F如序列SEQ ID NO：5所示；所述下游引物ACCOX2-I-R如序列SEQ ID NO：6所示。

本发明内容还包括所述的引物组合或所述的引物对在制备检测陈氏刺棘虫的试剂或试剂盒中的应用。

其中，所述应用中检测的样品为鱼样组织。

本发明内容还包括一种陈氏刺棘虫的检测试剂盒，所述陈氏刺棘虫的检测试剂盒包括所述的引物组合或所述的引物对。

作为优选，所述上游引物和下游引物的浓度比是3:4。

作为优选，所述陈氏刺棘虫的检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。