[发明专利]基于不同散射光纳米颗粒构建的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器

说明书

本发明属于暗场显微成像技术领域，涉及磁珠、DNA、金纳米颗粒(AuNPs)构建的多靶标可视化传感器，可用于同时检测乙肝和丙肝病毒DNA。该方法基于磁珠与两种不同形貌的AuNPs组装的核壳卫星结构构建的一种新型的多靶物高灵敏检测策略。与其他类似传感器相比，该传感器的探针制备简单、成本低、检测灵敏度高，可同时检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA的含量，其测定结果与临床标准方法吻合，可推广应用于其他病毒目标DNA的检测。

技术领域

本发明属于暗场显微成像技术应用领域，具体涉及基于两种不同颜色光散射的金纳米颗粒(AuNPs)、磁珠(MBs)和DNA构建的可视化传感器用于同时检测两种病毒目标DNA，本发明以检测乙肝(HBV)病毒DNA和丙肝(HCV)病毒目标DNA为目标。

背景技术

单颗粒光散射显微镜，又称暗场显微镜(DFM)，用于获取等离子体纳米颗粒的光散射信号。与明场显微镜不同，单颗粒光散射显微镜上配备暗场聚光镜，只允许斜射的光照射到样品上，从而激发等离子体纳米颗粒使其发出散射光，因此该系统具有高信噪比、实时监控的特点。散射光经过物镜之后一部分被导入到真彩电荷耦合器件(CCD)相机内以获取暗场图像，另一部分散射光输入光谱仪可得到单个纳米颗粒的散射光谱。基于灵敏度高、可实时动态分析等特点，DMF已广泛用于蛋白质、核酸等生物分子的分析检测。

金纳米颗粒由于具有独特的局域表面等离激元共振特性、光学及电子属性可调、生物相容性好、制备简单、稳定、易于表面改性及修饰等优点，在生物传感领域被用于各种物质的检测，例如DNA、RNA、蛋白质、小分子、离子等。此外，金纳米颗粒近年来在生物制药、生物传感、医学、生物成像等领域得到了广泛的研究与应用。其形状与尺寸可控的性质使金纳米颗粒在多组分生物分析中大放异彩。金纳米颗粒作为一种优良的光学探针，由于其光散射光学性质可通过调节其大小、组成、形貌和微环境来控制，近年来被广泛应用于生化和药物分析。此外，金纳米颗粒具有独特的局域表面等离激元共振(LSPR)特性，可以实现单粒子水平的实时成像，具有高时空分辨率和高灵敏度。现如今，利用暗场显微成像技术对于一种疾病标志物的检测策略已经报道了很多，但利用该技术实现同时检测多种疾病标志物的报道还很少。实际上，在早期疾病诊断中，一种生物标志物的检测可能会导致诊断结果出现误差，因此需要开发一种多种疾病标志物同时检测的方法，以实现早期疾病的精确诊断。在利用暗场测定多靶物时，不可避免地存在非特异性吸附，引起结果的不准确。本工作中，避免非特异性吸附，我们先将靶物作用后再沉积，并且引入信号放大策略，进一步提高了检测方法的灵敏度。

发明内容

本发明针对单颗粒光散射显微成像DNA传感器，提出了一种新颖的基于不同形貌的金纳米颗粒、磁珠、DNA构建的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，也是可称为一种多元单颗粒光散射显微成像DNA传感器。本发明还基于所述传感器，提供了一种简单、便捷、低成本和高灵敏的方法用于同时检测乙肝病毒标志物DNA和丙肝病毒标志物DNA，能够用于检测人血清中乙肝病毒目标DNA和丙肝病毒目标DNA，与临床结果吻合，取得了满意的结果。

本发明所述的多种肝炎病毒标志物单颗粒可视化传感器，包括AuNSs-CpHCV-MBs和AuNRs-CpHBV-MBs两种探针组合；所述AuNSs-CpHCV-MBs由金纳米球颗粒和HCV病毒捕获链以及磁珠构建而成；所述AuNRs-CpHBV-MBs由金纳米棒颗粒和HBV病毒捕获链以及磁珠构建而成。其中，两种探针组合的磁珠浓度为1.125-1.375mg/mL；金纳米球颗粒浓度为0.040-0.055nM；金纳米棒颗粒浓度为0.045-0.065nM，每种金纳米颗粒与对应的病毒捕获链的原料比率为1：300-1：500。优选的，磁珠浓度为1.250mg/mL，金纳米球颗粒浓度为0.048nM，金纳米棒颗粒浓度为0.056nM，金纳米球颗粒与HCV病毒捕获链的原料比率为1：300，金纳米棒颗粒与HBV病毒捕获链的原料比率为1：400。

其中，可视化传感器中还包括Exo III酶，浓度为0.800-1.200U/uL，优选为1.0U/uL。