[发明专利]一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法

说明书

本发明公开了一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法。属于生物医药领域，具体步骤：利用脱氧核酶对前体mRNA进行可变剪接，产生两个待连接片段；利用具有RNA连接活性的脱氧核酶对片段进行连接，形成成熟的RNA，验证脱氧核酶进行体外剪接的可行性；利用具有RNA切割活性的脱氧核酶切除目的前体信使RNA的一个内含子，产生两个待连接的RNA片段；通过体外筛选的技术手段获得具有RNA连接酶活性的苏糖核酸酶；利用苏糖核酸酶连接两个外显子，产生有功能的信使RNA；苏糖核酸酶较天然核酸酶具有稳定性好，不易降解，安全低毒等优点。本发明有效地实现RNA的剪接，为治疗由RNA剪接错误导致的疾病提供一种分子工具。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法。

背景技术

RNA剪接(RNA splicing)是真核细胞基因表达的一个重要过程，是指将转录产生的前体信使RNA的内含子去除，将外显子连起来形成一个连续的RNA的过程。体内RNA剪接是通过剪接体机制实现的，剪接机制发生错误会导致一些疾病的产生，比如半乳糖唾液酸贮积症，是由于组织蛋白酶A第7内含子的A突变成G，导致在剪接过程中发生第7外显子跳读，从而无法产生具有活性的蛋白。随着非天然核酸的发展，我们希望利用非天然核酸酶在体外实现RNA的正确剪接过程，为治疗由RNA错剪接导致的疾病提供一种分子工具。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法。

技术方案：本发明所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，包括如下步骤：

(1)、利用已有的具有RNA切割酶活性和具有RNA连接酶活性的脱氧核酶对前体mRNA进行可变剪接，验证实验的可行性；

(2)、通过体外筛选的技术手段，筛选具有RNA连接酶活性的TNA酶(苏糖核酸酶)；

(3)、首先，将所预备的目的基因的前体mRNA与脱氧核酶孵育，产生两个外显子片段；

随后，与筛选获得的TNA酶进行孵育，发生连接反应，产生成熟的RNA，利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

进一步，步骤(1)中，所述对前体mRNA进行可变剪接的方法具体是：利用具有RNA切割活性脱氧核酶对前体mRNA进行切割，切除内含子，获得具有2’,3’-环磷酸末端和具有5’羟基末端的两个外显子片段，然后利用具有RNA连接活性的脱氧核酶对两个外显子片段进行连接，形成一个成熟RNA。

进一步，步骤(2)中，所述体外筛选的技术手段包括以下步骤：在一个含有约10¹⁶个TNA文库中，通过施加筛选压力，分离并富集具有连接活性的TNA分子；

所述TNA文库的构建方法具体是：首先，固相合成一个DNA文库，利用KOD-RI的聚合酶通过延伸反应获得TNA文库；

所述的KOD-RI聚合酶的表达方法具体是：构建PQE-80-KOD-RI重组质粒，转化进入大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导表达，然后破碎细胞，提取并用柱层析法纯化聚合酶KOD-RI；

所述的分离方法具体是：在RNA左侧结合臂的5’端修饰生物素，使得带有生物素标记的序列与链霉亲和素磁珠结合，然后用100mM NaOH洗去互补配对，但没有连接活性的TNA序列；然后用200mM NaOH，在37℃下，破坏完成连接的RNA，留下具有连接活性的TNA分子；

所述的富集方法具体是：将分离得到的具有活性的TNA文库，先用Bst 2.0聚合酶，进行逆转录反应，得到与其互补的DNA文库，然后通过PCR技术指数富集DNA文库；