[发明专利]一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法

权利要求书

1.一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：

(1)、利用脱氧核酶对前体mRNA进行可变剪接；

(2)、通过体外筛选的方法获得具有催化RNA连接活性的TNA酶；

(3)、首先，将所预备的前体mRNA先与脱氧核酶进行孵育；

随后，与筛选获得的TNA酶进行孵育，发生连接反应，产生成熟的RNA，利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2.根据权利要求1所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

在步骤(1)中，所述利用脱氧核酶对前体mRNA进行可变剪接具体是：

首先，利用具有RNA切割活性的脱氧核酶对前体mRNA进行切割，切除内含子，从而获得具有2’,3’-环磷酸末端和具有5’羟基末端的两个外显子片段；

然后，再利用具有RNA连接活性的脱氧核酶对两个外显子片段进行连接，从而形成一个成熟RNA。

3.根据权利要求1所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

在步骤(2)中，所述的体外筛选的方法具体是：在一个含有约10¹⁶个TNA文库中，通过施加筛选压力，用于分离并富集具有活性的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

所述TNA文库的构建方法具体是：

首先，固相合成一个DNA文库；

然后，利用KOD-RI的聚合酶通过延伸反应从而获得TNA文库。

5.根据权利要求4所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

所述的KOD-RI聚合酶的表达方法具体是：

首先，构建PQE-80-KOD-RI重组质粒，转化进入大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导表达；

然后，通过破碎细胞，提取并用柱层析法纯化聚合酶KOD-RI。

6.根据权利要求3所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

所述的分离方法具体是：首先，在RNA左侧结合臂的5’端修饰生物素，使得带有生物素标记的序列与链霉亲和素磁珠结合，接着用100mM NaOH洗去互补配对，但没有连接活性的TNA序列；然后，用200mM NaOH，在37℃下，破坏完成连接的RNA，留下具有连接活性的TNA分子。

7.根据权利要求3所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

所述的富集方法具体是：首先，将分离得到的具有活性的TNA池，先用Bst 2.0聚合酶，进行逆转录反应，得到与其互补的DNA文库；然后，通过PCR技术指数富集DNA文库。

8.根据权利要求1所述的一种通过体外筛选产生对RNA进行可变剪接分子工具的方法，其特征在于，

在步骤(3)中，所述与筛选获得的TNA酶进行孵育具体是：具有2’,3’-环磷酸末端和具有5’羟基末端的两个外显子在TNA连接酶的作用下进行连接反应。