[发明专利]一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法

说明书

本发明属于SNP位点基因分型技术领域，具体涉及一种基于nMALDI‑TOF技术的多SNP位点基因分型方法。包括：针对待测样本DNA的多个SNP设计并合成探针以及PCR扩增引物；将探针和样本DNA进行杂交；杂交反应产物中加入延伸连接反应液，混匀，进行延伸、连接；延伸、连接反应产物中加入外切酶混合液，混匀，进行酶切；酶切反应产物中加入S5N7引物的混合液、纯化水、PCR预混液，混匀，进行PCR反应；PCR反应产物脱盐后，上样至MALDI‑TOF‑MS检测，得到检测结果。本发明在结果准确的基础上，可将操作时间缩短一半。

技术领域

本发明属于SNP位点基因分型技术领域，具体涉及一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法。

背景技术

核酸质谱检测技术是在MALDI-TOF原理的基础上，结合引物延伸分析法和碱基特异裂解分析法，针对双链DNA的特性进行特殊优化，使样品在电离过程中不产生或产生较少的碎片离子，可检测生物样品中的核酸分子量，是研究基因组单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)的重要手段，这一技术近年来被广泛应用在精准医疗检测项目中。核酸质谱检测分四个步骤完成：①样本的DNA提取及DNA质检；②基因位点选择及引物设计、合成与质检；③样品DNA的3步反应(PCR扩增、SAP反应纯化及单碱基延伸反应)；④反应产物上样至专用芯片用MALDI-TOF-MS检测，得到检测结果。用飞行时间质谱技术检测核酸，实验结果稳定，与以凝胶电泳为基础的测序法相比，具有分辨率高、分离速度快、杂质干扰少的优点。质谱技术在基因分型方面的应用有大量文献做深入分析，基因分型检测被广范应用于疾病诊断，是基因分型分析的利器。

应用该技术进行基因分型的常规方案在进行PCR扩增、SAP反应纯化及单碱基延伸反应，所用操作时间超7.3h，无法当天出检测结果。

发明内容

为解决上述技术问题，缩短基因分型的操作时间，本发明提供了一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法。

本发明采用如下技术方案：

一种基于nMALDI-TOF技术的多SNP位点基因分型方法，包括如下步骤：

S1、针对待测样本DNA的多个SNP位点设计并合成探针以及PCR扩增引物，所述探针为拱桥式探针，包括两端的探针结合区和中间的探针臂，所述探针臂为非人类序列；

S2、将探针和样本DNA进行杂交；

S3、在S2的杂交反应产物中加入延伸连接反应液，混匀，然后进行延伸、连接；

S4、在S3的反应产物中加入核酸外切酶Ⅶ，混匀，进行酶切；

S5、在S4的反应产物中加入S5N7引物的混合液、纯化水、PCR预混液，混匀，进行PCR反应；

S6、将S5的反应产物脱盐后，上样至专用芯片用MALDI-TOF-MS检测，得到检测结果。

进一步的，所述探针臂序列为TAGATCGCTAAGGCGA。

进一步的，所述S5N7引物序列如下：

S5引物：5'-TAGATCGC-3'；

N7引物：5'-TAAGGCGA-3'。

进一步的，S2的杂交反应体系为：X ul的样本DNA，1ul的探针MIX，1ul的杂交缓冲液，纯化水补足10ul，X表示10～50ng DNA样本体积。

更进一步的，S2的杂交反应程序为：98℃，5min；60℃，1.5h；4℃，保持。

更进一步的，S3中延伸连接反应液的加入量为1ul，延伸、连接的程序均为：60℃，10min；4℃，保持。