[发明专利]一种筛选D2R与NR2B相互作用阻断剂的方法

说明书

本发明提供一种筛选多巴胺受体D2R与谷氨酰胺受体NR2B相互作用的阻断剂的方法，涉及生物医药技术领域。本申请中，通过简单表达两个蛋白在同一个细胞中，细胞中D2R和NR2B的相互作用可以以酶学反应的形式得到检测。表达D2R和NR2B的细胞可以通过分液器快速均匀的分到384孔板，化合物也可以通过分液器快速加入到384孔板，最后简单的加入Nano荧光素酶的底物就可以准确知道化合物是否可以干扰D2R和NR2B在细胞中的互作。常规的实验方法，检测10个小分子化合物或者大分子样本，需要至少两天的时间。我们的高通量筛选，两天可以检测20，000个以上的样本。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种筛选D2R与NR2B相互作用阻断剂的方法。

背景技术

服用成瘾性药物可导多巴胺致在杏仁核累积，进而持续改变兴奋性谷氨酸递质释放并劫持自然奖励信号通路。有研究揭示，从小鼠到人类，成瘾性药物均可激活谷氨酸受体（NMDAR）与多巴胺受体2（D2R）形成异源二聚体。打断该异源二聚体的形成，既可有效阻断药物成瘾又可避免机体本身的奖励信号通路的干扰。虽然目前已有多种小分子药物可以单独抑制谷氨酸受体（NMDAR）或者多巴胺受体2（D2R）的生物学活性，因为这两个受体在体内有非常重要的生理功能，因此，这类抑制剂不适合用于药物成瘾治疗。单独筛选谷氨酸受体（NMDAR）与多巴胺受体2（D2R）抑制剂的技术路线已经非常成熟，但是目前尚没有可行的技术用于高通量筛选谷氨酸受体（NMDAR）与多巴胺受体2（D2R）相互作用的抑制剂。本发明解决了这方面的技术难题，可以用高通量筛选的方法，发现小分子化合物，并利用它们特异性的阻断谷氨酸受体（NMDAR）与多巴胺受体2（D2R）形成异源二聚体。

在一般的分子生物学实验中，常用的检测蛋白互作的方法在分子水平是免疫共沉淀，在细胞水平一般是应用抗体共标进行鉴定。这两个方法的共同缺点是试验周期比较长，检测的样品数目有限。对于检测的分子数量比较多时，这两个方法实际操作上不具备可行性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中常规实验方法对于检测的分子数量比较多时，这两个方法实际操作上不具备可行性。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种筛选D2R与NR2B相互作用阻断剂的方法，包含以下步骤：

S1：在D2R受体的羧基端融合Nano荧光素酶的大亚基LgBIT；在NR2B的羧基端融入Nano荧光素酶低亲和力的小亚基SmBIT；

S2：利用脂质体将D2R-LgBIT和NR2B-SmBIT表达质粒共转染到HEK293细胞，并在48小时后，洗脱细胞并计数；然后将细胞分别利用移液器接种到384孔板，离心沉淀细胞；

S3：将有生物学活性的化合物以适当的浓度稀释到DMEM中，每孔加入5微升化合物，让化合物与D2R-NR2B二聚体充分结合；

S4：30分钟后，在每孔细胞加入20微升Nano荧光素酶底物加入荧光素酶底物，室温孵育15分钟后利用高速酶标仪读板。

优选的，在D2R受体的羧基端融合Nano荧光素酶的大亚基LgBIT；在NR2B的羧基端融入Nano荧光素酶低亲和力的小亚基SmBIT

优选的，所述S2中细胞数的数值范围为2000-20000个/20微升/孔；读板时间为2-30分钟。

优选的，所述S2中细胞数为2000个/20微升/孔；读板时间为10分钟。

优选的，所述S3中DMSO的浓度为0.5%。