[发明专利]一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的可控构建及其应用

说明书

本方法涉及分子生物学技术领域，具体涉及利用Y型分支DNA组装的一种比例可调的树枝状聚合物及其用于miRNA的检测方法。该方法利用Y型分支DNA组装了一种比例可调的树枝状聚合物，通过碱基的合理设计可以在其表面修饰上不同比例的脱氧核酶和底物链，在目标miRNA存在下，脱氧核酶被激活，然后切割同轨道上的底物链，荧光恢复。本发明利用由DNA构成的具有较高的生物相容性和稳定性纳米结构，在进行细胞内目标物的检测时能大大降低假阳性信号，并且实现了探针的精准可控组装以获得最佳的响应性能。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种利用Y型分支DNA组装而成的树枝状聚合物的可编程性、结构稳定、具有大小可调、多价性和对称性可控构建以及脱氧核酶的特异性识别能力用于miRNA的检测，具体涉及利用Y型分支DNA组装的一种比例可调的树枝状聚合物及其用于miRNA的检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非蛋白编码的单链小分子RNA(19-25个核苷酸)，在调控基因表达过程中起关键作用。已有研究表明，miRNA参与多种生物学过程，包括增殖、代谢和凋亡。此外，miRNA的表达与许多疾病发生有关，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病。因此，它们作为预后和诊断的生物标志物而受到广泛关注。然而，miRNA的低丰度和较高的序列相似性给量化它们带来了很大的挑战。

脱氧核酶作为一种催化型功能核酸，被广泛应用到细胞内miRNA的检测。比较常见的是使用金纳米颗粒(AuNP)负载的脱氧核酶马达在识别目标物后对同轨道上的荧光底物链进行行走切割。这种由脱氧核酶驱动的分子马达在一定程度上有效加速了对目标物的检测，但是基于Au-S键固定在AuNP表面的核酸链在进入细胞后，由于细胞内高浓度的硫醇类物质如谷胱甘肽的干扰，Au-S键非常容易被切断，导致荧光链的脱落，从而出现假阳性信号。并且，将核酸修饰到AuNP表面时，由于微观不可控，其表面修饰上的脱氧核酶与底物链的数量和比例难以精准控制，不利于实验的进行。

近些年来，基于DNA纳米结构构建的核酸载体逐渐受到研究者们的青睐，如四面体、三棱柱、纳米线、Y型分支DNA等。其中，使用Y型分支DNA组装而成的树枝状聚合物具有可编程性、可操作性、结构稳定及生物相容性好等特性，而且还具有大小可调、多价性和对称性可控等优点，已逐渐成为一种具有发展前景的多功能的核酸载体。因此，基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器由于其较高的生物相容性和稳定性，在进行细胞内目标物的检测时能大大降低假阳性信号，并且实现了探针的精准可控组装以获得最佳的响应性能。

发明内容

本发明为解决常见的金纳米颗粒负载的脱氧核酶驱动的分子马达由于细胞内高浓度的硫醇类物质如GSH干扰，导致假阳性信号以及核酸修饰到AuNP表面的微观不可控性，提出一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的可控构建及其用于miRNA的检测方法。这样由DNA 构成的纳米结构由于其较高的生物相容性和稳定性，在进行细胞内目标物的检测时能大大降低假阳性信号，并且实现了探针的精准可控组装以获得最佳的响应性能。

实现本发明的技术方案是：一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的构建，步骤如下：

一种Y型分支DNA纳米步行机器，其特征在于：所述DNA纳米步行机器由Y型DNA、封闭的脱氧核酶和酶切底物分步组装所得；粒径约为45nm。Y型分支DNA纳米步行机器对miRNA-21的检测限为23pM。

所述的Y型分支DNA纳米步行机器的制备方法，步骤如下：

(1)将等摩尔的Y0a、Y0b、Y0c加到Tris-HCl缓冲液中混匀后在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温得到Y0，然后使用相同方法进行Y1(Y1a、Y1b、Y1c)和Y2(Y2a、 Y2b、Y2c)的制备；将一条Dz-7脱氧核酶和一条封闭住其一端结合臂的封锁链(locker)一起混合溶于Tris-HCl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的D-L；