[发明专利]一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的可控构建及其应用

权利要求书

1.一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的可控构建及其应用，其特征在于：所述DNA纳米步行机器由Y型DNA、封闭的脱氧核酶和酶切底物分步组装所得；粒径约为45nm。Y型分支DNA纳米步行机器对miRNA-21的检测限为23pM。

2.根据权利要求1所述的Y型分支DNA纳米步行机器的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)将等摩尔的Y0a、Y0b、Y0c加到Tris-HCl缓冲液中混匀后在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温得到Y0，然后使用相同方法进行Y1(Y1a、Y1b、Y1c)和Y2(Y2a、Y2b、Y2c)的制备；将一条Dz-7脱氧核酶和一条封闭住其一端结合臂的封锁链(locker)一起混合溶于Tris-HCl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的D-L；

(2)将步骤(1)中的1体积的Y0(G0)先与3体积的Y1在室温下孵育3h得到G1，再加入6体积的Y2继续孵育3h得到G2，最后加入6体积的D-L和6体积的MB再孵育3h得到G3，即Y型分支DNA纳米步行机器。

3.根据权利要求2所述的Y型分支DNA纳米步行机器，其特征在于：所述步骤(1)中Y0a的序列为5’-GACCGATGGATGACCTGTCTGCCTAATGTGCGTCGTAAG-3’；Y0b的序列为5’-GACCGATGGATGACTTACGACGCACAAGGAGATCATGAG-3’；Y0c的序列为5’-GACCGATGGATGACTCATGATCTCCTTTAGGCAGACAGG-3’；Y1a的序列为5’-GAAGCCACTCTGACCTGTCTGCCTAATGTGCGTCGTAAG-3’；Y1b的序列为5’-GGAAGCCACTCTGACTTACGACGCACAAGGAGATCATGAG-3’；Y1c的序列为5’-TCATCCATCGGTCCTCATGATCTCCTTTAGGCAGACAGG-3’；Y2a的序列为5’-GACACACTGAGGTCCTGTCTGCCTAATGTGCGTCGTAAG-3’；Y2b的序列为5’-GCTGTCATCGGTCACTTACGACGCACAAGGAGATCATGAG-3’；Y2c的序列为5’-TCAGAGTGGCTTCCTCATGATCTCCTTTAGGCAGACAGG-3’；Dz-7的序列为5’-ACCTCAGTGTGTC(T)40TCAGACTGATGTTGATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGC-3’；locker的序列为5’-AAGAGATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’。Tris-HCl缓冲液为20mM Tris-HCl、300mMNaCl、5mM MgCl₂、pH 8.3。

4.根据权利要求2所述的Y型分支DNA纳米步行机器的制备方法，其特征在于：将每种Yn对应的三条基底链各取4μL原液(100μM)加到8μL Tris-HCl缓冲液中，混匀后分别在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温，即得到20μM的Yn储备液。取2μL Dz-7原液和2μL locker原液，一起混合溶于6μLTris-HCl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的D-L和发夹型MB。

5.根据权利要求2所述的Y型分支DNA纳米步行机器的制备方法，其特征在于：首先取1μLY0和3μLY1储备液，溶于8μLTris-HCl缓冲液中，室温下震荡孵育2h得到G1；然后加入6μLY2储备液，继续震荡孵育3h得到G2；最后分别各取6μL的D-L和6μL的MB加入反应液，继续反应3h。最后得到实验所用的浓度为2/3μM的1:1型的G3。

6.权利要求1所述的Y型分支DNA纳米步行机器在活细胞或凋亡细胞成像中的应用。