[发明专利]一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法

说明书

本发明公开了一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，该方法包含：原生质体制备和原生质体瞬时转化；所述原生质体制备，包含：将柴胡下胚轴愈伤组织经酶解液在避光条件下酶解处理，并进行纯化，得到柴胡原生质体；所述原生质体瞬时转化，包含：将所述柴胡原生质体和Crispr/Cas9‑T3T4质粒混合，加入聚乙二醇转化液，室温孵育，待孵育结束后加入W5溶液终止反应，离心收集经过瞬时转化的柴胡原生质体，并重悬于MMG溶液中，室温避光孵育。本发明的方法能够实现柴胡下胚轴愈伤原生质体的制备，采用本发明的方法制备的原生质体完整好，浓度可达10⁶个/mL，可有效保证瞬时转化及原生质培养的浓度要求。

技术领域

本发明涉及一种原生质体的制备及转化方法，具体涉及一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法。

背景技术

柴胡(Radix Bupleuri)是一种中药材，《中国药典》规定正品柴胡为北柴胡及狭叶柴胡的干燥根。近年来对北柴胡的研究主要集中在采用传统育种方法培育柴胡新品种，这些方式耗时长，效率低。目前结合基因组学、分子生物学的基因编辑技术已成为新品种选育的有力工具。但是，由于柴胡转化体系技术还不成熟，制约了利用转基因技术研究柴胡基因功能，而利用原生质体可以对植物基因功能进行快速验证，因而，对柴胡原生质体制备与转化研究具有重要意义，但目前尚未有对柴胡建立外源基因转化体系的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，解决了目前柴胡转化体系技术还不成熟的问题，该方法制备的原生质体完整好，浓度可达10⁶个/mL，可有效保证瞬时转化及原生质培养的浓度要求。

为了达到上述目的，本发明提供了一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，该方法包含：原生质体制备和原生质体瞬时转化；所述原生质体制备，包含：将柴胡下胚轴愈伤组织经酶解液在避光条件下酶解处理，并进行纯化，得到柴胡原生质体；所述原生质体瞬时转化，包含：将所述柴胡原生质体和Crispr/Cas9-T3T4质粒混合，加入聚乙二醇转化液，室温孵育，待孵育结束后加入W5溶液终止反应，离心收集经过瞬时转化的柴胡原生质体，并重悬于MMG溶液中，室温避光孵育，并通过基因编辑靶位点分析验证原生质体是否转化成功；其中，其中，所述Crispr/Cas9-T3T4质粒为pHEE401E-T3T4质粒，其构建为：以pCBC-DT1T2质粒为模板，采用核苷酸序列为SEQ ID NO.6～9的引物，进行Overlapping PCR构建sgRNA表达盒，将产物连接至pHEE401E质粒，从而构建pHEE401E-T3T4质粒。

优选地，所述柴胡下胚轴愈伤组织的制备，包含：将柴胡种子用无菌水浸泡，去除漂浮的种子，将种子转移用加2％PPM的无菌水在4℃暗光振荡消毒；将消毒后的种子转移至种子萌发培养基中培养，该种子萌发培养基包含：MS基础培养基、30g蔗糖、4g植物凝胶、0.1％PPM；取发芽的柴胡幼苗，切取柴胡下胚轴并置于愈伤诱导培养基中诱导愈伤组织，该愈伤组织诱导培养基包含：MS基础培养基、30g蔗糖、4g植物凝胶、0.5％PPM、3mg/L 6-BA、2.2mg/L 2,4-D、0.8mg/LKT。

优选地，所述发芽的柴胡幼苗为发芽14～16天的柴胡幼苗。

优选地，所述消毒时间为12h。

优选地，所述酶解液包含：2％Cellulase R-10、1％Macerozyme R-10、0.4M甘露醇、20mM pH＝5.7的MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％BSA和ddH₂O。

优选地，所述酶解液包含：2％Cellulase R-10、1％Macerozyme R-10、0.4M甘露醇、20mM pH＝5.7的MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％BSA和ddH₂O。