[发明专利]一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法

权利要求书

1.一种柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，该方法包含：原生质体制备和原生质体瞬时转化；

所述原生质体制备，包含：

将柴胡下胚轴愈伤组织经酶解液在避光条件下酶解处理，并进行纯化，得到柴胡原生质体；

所述原生质体瞬时转化，包含：

将所述柴胡原生质体和Crispr/Cas9-T3T4质粒混合，加入聚乙二醇转化液，室温孵育，待孵育结束后加入W5溶液终止反应，离心收集经过瞬时转化的柴胡原生质体，并重悬于MMG溶液中，室温避光孵育，并通过基因编辑靶位点分析验证原生质体是否转化成功；

其中，所述Crispr/Cas9-T3T4质粒为pHEE401E-T3T4质粒，其构建为：

以pCBC-DT1T2质粒为模板，采用核苷酸序列为SEQ ID NO.6～9的引物，进行Overlapping PCR构建sgRNA表达盒，将产物连接至pHEE401E质粒，从而构建pHEE401E-T3T4质粒。

2.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述柴胡下胚轴愈伤组织的制备，包含：

将柴胡种子用无菌水浸泡，去除漂浮的种子，将种子转移用加2％PPM的无菌水在4℃暗光振荡消毒；

将消毒后的种子转移至种子萌发培养基中培养，该种子萌发培养基包含：MS基础培养基、30g蔗糖、4g植物凝胶、0.1％PPM；

取发芽的柴胡幼苗，切取柴胡下胚轴并置于愈伤诱导培养基中诱导愈伤组织，该愈伤组织诱导培养基包含：MS基础培养基、30g蔗糖、4g植物凝胶、0.5％PPM、3mg/L 6-BA、2.2mg/L 2,4-D、0.8mg/L KT。

3.根据权利要求2所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述发芽的柴胡幼苗为发芽14～16天的柴胡幼苗。

4.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述酶解液包含：2％Cellulase R-10、1％Macerozyme R-10、0.4M甘露醇、20mM pH＝5.7的MES、20mMKCl、10mM CaCl₂、0.1％BSA和ddH₂O。

5.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述聚乙二醇转化液包含：40％PEG4000、0.2M甘露醇、100mMCaCl₂；所述MMG溶液包含：0.4MMannitol、15mM MgCl₂、4mM pH＝5.7的MES；所述W5溶液包含：8.9g/LNaCl、18.4g/L CaCl₂、0.37g/LKCl、0.9g/L葡萄糖。

6.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述纯化，为：通过W5溶液稀释所述酶解处理的溶液，经70μm滤网过滤，离心，将沉淀重悬于MMG溶液，得到纯化的原生质体。

7.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述酶解处理的温度为27～29℃。

8.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述室温避光孵育的时间为24h以上。

9.根据权利要求1所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述基因编辑靶位点分析，为：提取经过瞬时转化的柴胡原生质体的总DNA，作为模板，使用靶位点引物进行PCR反应，将PCR扩增获得的PCR片段克隆至T载体，转化大肠杆菌后，测序验证原生质体是否转化成功；

其中，所述靶位点引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述测序验证原生质体是否转化成功，为：若核苷酸序列SEQ IDNO.4中第8位的C变T，或者第21位的G变A，则表明靶位点已被编辑，原生质体转化成功。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的柴胡原生质体的制备及瞬时转化方法，其特征在于，所述柴胡包含：川北柴一号、川红柴一号。