[发明专利]一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。该基因工程菌株异源过表达核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF^K316QMNHD和PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q，并且以异源腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA^P242N替换了基因purA，并且不表达嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。本发明从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对肌苷分解途径、肌苷合成途径、肌苷转运系统及分支代谢途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的肌苷发酵性能。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

肌苷是一种嘌呤核苷，参与机体物质代谢和能量代谢，具有重要的应用价值。微生物发酵法是目前工业生产肌苷的主要方法，但由于现存菌株的发酵性能较差，发酵法生产肌苷的生产水平仍较低，亟需高性能的菌株以满足肌苷的产业化需求。传统肌苷生产菌株的选育是通过诱变筛选结构类似物抗性菌株获得，然而由于遗传背景不清晰和大量负向突变的积累，不利于诱变所得菌株性能的持续改良。随着系统生物学的发展，代谢工程等理性构建的方法逐渐成为肌苷生产菌株从头构建和持续改良的首选方法。现有研究成果已为肌苷工程菌株的理性构建提供了重要参考，但仍存在许多问题尚未解决。具体表现在：(1)目前理性构建菌株的肌苷生产性能普遍偏低，最高产量仅为14g/L，且生产周期较长，普遍长达72h甚至更久。(2)菌株多携带质粒，菌体负担重，并且质粒易丢失会造成生产的不稳定。为维持质粒的稳定存在需添加抗生素，不仅提高了生产成本，也增加耐药性等安全隐患。(3)在构建策略方面，现有菌株多局限在对降解途径、从头合成途径、前体合成途径和分支代谢途径等个别节点进行改造，缺乏对整个肌苷代谢网络各模块的系统组合。(4)菌株多为腺嘌呤缺陷型，发酵过程中需要添加腺嘌呤，原料成本高、发酵工艺复杂、生产稳定性降低。