[发明专利]一种生产肌苷的基因工程菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株异源过表达核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF^K316QMNHD和PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q，其中purF^K316Q是purF基因编码氨基酸序列第316位的赖氨酸替换为谷氨酰胺，并且以异源腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA^P242N替换了基因purA，并且不表达嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述核苷转运蛋白基因pbuE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或

所述PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或

所述嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF^K316QMNHD的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；和/或

所述腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA^P242N的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述核苷转运蛋白基因pbuE连接有启动子P_trc；和/或

所述嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF^K316QMNHD连接有启动子P_trc；和/或

所述PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q连接有启动子P_trc；

所述启动子P_trc的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：用于构建所述大肠杆菌基因工程菌株的出发菌株是E.coli MG1655。

5.权利要求1-4任一所述基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括：在出发菌株大肠杆菌中引入核苷转运蛋白基因pbuE，嘌呤操纵子突变基因purEKBCSQLF^K316QMNHD和PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q，其中purF^K316Q是氨基酸序列第316位的赖氨酸替换为谷氨酰胺，并且以腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA^P242N替换了基因purA，并且将嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除或失活。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法进一步包括：

(1)从菌株E.coli MG1655基因组出发，敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因deoD、ppnP，并敲除核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC；

(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的嘌呤操纵子purEKBCSQLF^K316QMNHD与启动子P_trc的融合片段P_trc-purEKBCSQLF^K316QMNHD整合在yghE假基因位点；

(3)将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的PRPP转酰胺酶突变基因purF^K316Q与启动子P_trc的融合片段P_trc-purF^K316Q整合在yeeP假基因位点；

(4)将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核苷转运蛋白基因pbuE与启动子P_trc的融合片段P_trc-pbuE整合在yjiT假基因位点；

(5)将腺苷琥珀酸合成酶基因purA替换为核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的突变基因purA^P242N，获得所述基因工程菌株。

7.权利要求1-4任一所述基因工程菌株在发酵生产肌苷中的应用。