[发明专利]用于HPV分型的多靶标核酸检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于HPV分型的多靶标核酸检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括RPA扩增体系，Cas12a‑crRNA的酶及缓冲液体系，以及显示信号的报告分子，检测方法以多通道微流控芯片为载体，针对HPV不同亚型的对应区域设计RPA引物并进行等温扩增，然后针对不同亚型的扩增子设计出crRNA组合，crRNA识别样品中的HPV靶标后激活CRISPR‑Cas12a并剪切报告基团释放信号，从而实现HPV多亚型的精准检测。本方法灵敏度高、成本低、操作方便，有望广泛用于HPV感染的筛查。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于HPV多亚型检测和分型 的试剂盒和检测方法。通过结合微流控芯片、多重RPA核酸扩增以及多重 CRISPR/Cas12a实现样本中HPV多亚型的检测和分型。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种无被膜包被的、环状 双链DNA病毒，含有大约7900对碱基，分为3个基因区：早期区(Early Region， E区)、晚期区(LateRegion，L区)和非编码区(Uncoding Region，UCR)或 上游调控区(URR)。E区分为E1-E7共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能，其中E6和E7基因是HPV的主要致癌基因。L区 编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2，HPV的分型主要依据L1区的DNA 同源性，因此进行HPV分型时常以该区域为目标设计引物。非编码区含有HPV 基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。

目前已经发现的HPV有170多种亚型之多，其中40多种可以感染生殖腔。 1974年Zur Hausen提出HPV感染与宫颈癌有密切关系，1995年WHO和IARC 将HPV确定为宫颈癌的病因。HPV亚型分为高危型和低危型，高危型包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82 等型别，其中HPV 16和HPV 18是全球最常见的基因型，约占所有侵袭性宫颈 癌病例的70％；低危型包括HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、81等型别， 主要引起尖锐湿疣。

需要强调的是，人类感染HPV后不一定会致病，因为机体的免疫系统可清 除HPV，所以绝大多数生殖道HPV感染可能并不会产生没有临床症状，是一过性的；据统计，约90％HPV感染在2年内会消失，其消失的具体时间主要 由所感染的HPV型别所决定，低危型较快会消失(约5-6个月)，高危型可能 需要8-24个月，少数HPV感染者无法消灭体内的HPV而造成临床可见的生 殖道疣、鳞状上皮内病变；若女性持续受到HPV感染，则最终可能会发展为宫颈癌。正由于不同HPV亚型的危害程度不同，需要及时对其筛查、鉴别和防治。HPV疫苗，简称宫颈癌疫苗，又称人类乳头瘤病毒疫苗，目前主要有二价、四 价和九价三种；它是人类第一个预防恶性肿瘤的疫苗，能预防子宫颈癌及其他因 感染HPV而引致的癌症和疾病。接种了二价宫颈癌疫苗(针对HPV 16/18)，可 使得女性今后患上宫颈癌的风险大大减少；四价宫颈癌疫苗在HPV 16/18基础上 增加了HPV 6/11二种低危型亚型,从而可预防更多的HPV感染，不但可减少宫 颈癌的风险，还可以预防男女性常见的性病皮肤病，因为低危型的HPV也会引 起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变等；九价宫颈癌疫苗，是在四价苗的基础上又增加了属于高风险组的HPV31/33/45/52/58五种亚型，是目前功能最强大的宫颈癌疫苗。

宫颈癌的发病率居全球女性恶性肿瘤的第2位，仅次于乳腺癌，每年约有 50万宫颈癌的新发病例，其中1/3为死亡病例，而90％以上的宫颈癌都是由HPV 感染引起的，除了上述提到的及时注射宫颈癌疫苗之外，针对HPV的检测也具 有重要意义且刻不容缓，不仅如此，由于不同亚型HPV的致病机制、致癌危险 性及感染后的预后各不相同，因此对HPV各亚型进行分型检测可以用于辅助临 床的诊断及治疗。