[发明专利]肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法。该引物探针组合物包括：正向引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；正向引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；探针P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明特异性强、灵敏度高且较为可靠，适用于肝癌的预防早筛和预后监测。

技术领域

本发明属于肝癌检测试剂盒领域，涉及一种肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法，特别是一种基于甲基化荧光定量PCR的肝癌早筛试剂盒。

背景技术

肝癌是一种高度血管化的肿瘤，在肿瘤死亡中排名第2位。肝癌的死亡数逐年上升，在中国，肝癌每年死亡人数38,3000，占世界肝癌死亡人数的51％。肝癌确诊病人有50％在1年内死亡，低于6％的病人平均存活时间为5年。肝癌最常见的风险因素包括吸烟、饮酒、黄曲霉毒素、代谢综合征、乙型肝炎病毒(HBV)或者丙型肝炎病毒(HCV)的长期慢性感染等。近年来，肥胖和2型糖尿病的发病率逐年升高。2型糖尿病在中国的发病率为10％，超重和肥胖的发病率30％，而肥胖和2型糖尿病促进肝癌的发生和进展。此外，对乙肝疫苗的接种缺乏认识和乙型肝炎病毒(HBV)的常规检测，都增加了肝癌的发病率。

目前，血清甲胎蛋白(AFP)是应用最广泛的肝癌血清生物标志物之一，在肝癌发病中起重要作用，如肝癌的筛查、临床表现诊断和评估。AFP的灵敏度为62.4％，临界值为20ng/ml，对早期检测不够敏感和准确，可能出现假阴性结果。并且，AFP在慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血浆中都有升高，经常导致误诊。

影像学技术(CT、MRI或CEUS)仅对直径大于1cm的结节的检测灵敏度从66％提高到82％，特异性提高到90％以上。

所以，迫切需要开发一种有效的检测方法可以检测早期、低级别、残留和复发肿瘤，来提高疾病的控制效率。幸运的是，肝癌的DNA甲基化的生物标志物有助于提高肝癌诊断和预后的准确性。

在高风险的肝癌人群中，DNA甲基化谱可用于肝癌的早期检测。DNA甲基化是基因表达的关键表观遗传调控因子，异常DNA甲基化是肿瘤发生(包括肝癌)过程中所有类型癌症最常见的表观遗传改变之一，介导肿瘤的起始、进展、侵袭、转移和耐药性。DNA的甲基化状态的改变是肿瘤发生过程中最早可以被检测出的癌样改变。DNA甲基化在化学上是稳定的，并且可以被实验量化，使其成为肝癌检测、诊断、预后和肿瘤复发的一种有前景的肿瘤标志物。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR技术现已被广泛用于各种临床疾病、动物疾病、食品安全及科学研究中。如对肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤疾病诊断，遗传基因检测实现对遗传病诊断。

甲基化特异性荧光定量PCR，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化序列的引物进行PCR。通过荧光信号检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

利用甲基化特异性荧光定量PCR技术检测肿瘤的表观遗传学变化在肿瘤的早筛、诊断和预后监测中被广泛应用，如结直肠癌、胰腺癌等。目前虽已有将实时荧光定量PCR应用于肝癌筛查中，但其检测的准确度和灵敏度有待于进一步提高，不适于进行肝癌的预防早筛。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种肝癌早期筛查的引物探针组合物、试剂盒及方法，其特异性强、灵敏度高且较为可靠。