[发明专利]基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法

说明书

本发明公开了一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，该方法中：末端修饰了二茂铁的探针A修饰于金电极表面，探针B‑C杂交体连接在探针A上，在目标核酸的驱动下可将探针C置换，使探针B末端修饰的亚甲基蓝信号分子靠近金电极表面，并通过激活DNAzyme催化探针A裂解释放二茂铁信号分子，游离的探针序列还能够进一步激活其他DNAzyme，从而放大信号，通过研究双信号的强度变化对比可实现对目标核酸的定量分析。本发明通过对目标循环肿瘤DNA触发的双重电化学信号变化的综合分析后能够实现循环肿瘤DNA浓度的超灵敏定量分析，且检测方法简单，易于操作，对循环肿瘤DNA特异性强，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法。

背景技术

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一种特征性的肿瘤生物标志物。ctDNA一般是从肿瘤部位脱落到血液循环中，通过ctDNA检测，能够检出血液中的肿瘤踪迹。通过对ctDNA的检测与分析，可以为肿瘤的研究提供一些具有重要参考意义的信息。与需要手术或活检的组织DNA生物标志物相比，ctDNA获取方便，成本低；与组织分析相比，使用ctDNA分析能够实现连续监测，更快地提供结果，并有可能提供患者体内所有肿瘤部位基因改变的综合数据。此外，ctDNA还可用于预测对特定疗法的反应，确定治疗机制、耐药性等。例如，第一例在临床应用的ctDNA测试是EGFR突变检测，用于预测非小细胞肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的反应。要将ct DNA检测引入常规临床应用，目前医护人员需要接受PCR、测序等试验技能的培训，此外，现有的多种ctDNA的检测方法或试剂盒等较为复杂，需要简化、标准化才能够在合理成本情况下满足临床应用需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，该方法包括：

提供一条含有颈环结构且末端修饰了第一信号分子的DNA探针A，所述DNA探针A修饰于金电极表面；

提供由不完全互补配对的DNA探针B与DNA探针C杂交得到的探针B-C杂交体，通过碱基互补配对原则使所述探针B-C杂交体连接在所述DNA探针A上，从而也固定于所述金电极表面，所述DNA探针B的末端修饰有第二信号分子；

采用电化学检测方法，利用修饰有DNA探针A和探针B-C杂交体的金电极并结合激活DNAzyme的策略对目标ctDNA(循环肿瘤DNA)进行检测：当目标ctDNA存在时，目标ctDNA可置换所述探针B-C杂交体中的DNA探针C，并与DNA探针A、DNA探针B形成DNAzyme结构，使得DNA探针B末端修饰的第二信号分子靠近金电极表面，从而使得第二信号分子的信号强度增大；并通过激活DNAzyme催化DNA探针A的裂解，释放出第一信号分子，使得第一信号分子的信号强度降低，DNA探针A裂解后形成的游离的探针序列进一步激活其他DNAzyme，从而放大信号；最后通过电化学检测方法分析第一信号分子和第二信号分子的信号强度的变化，实现目标ctDNA的定量检测。

优选的是，所述第一信号分子为二茂铁。

优选的是，所述第二信号分子为亚甲基蓝。

优选的是，其中，通过向反应体系中加入辅酶因子来激活DNAzyme。

优选的是，其中，辅酶因子为Mg²⁺。

优选的是，该方法具体包括以下步骤：

1)金电极预处理；