[发明专利]基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法

权利要求书

1.一种基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，该方法包括：

提供一条含有颈环结构且末端修饰了第一信号分子的DNA探针A，所述DNA探针A修饰于金电极表面；

提供由不完全互补配对的DNA探针B与DNA探针C杂交得到的探针B-C杂交体，通过碱基互补配对原则使所述探针B-C杂交体连接在所述DNA探针A上，从而也固定于所述金电极表面，所述DNA探针B的末端修饰有第二信号分子；

采用电化学检测方法，利用修饰有DNA探针A和探针B-C杂交体的金电极并结合激活DNAzyme的策略对目标ctDNA进行检测：当目标ctDNA存在时，目标ctDNA可置换所述探针B-C杂交体中的DNA探针C，并与DNA探针A、DNA探针B形成DNAzyme结构，使得DNA探针B末端修饰的第二信号分子靠近金电极表面，从而使得第二信号分子的信号强度增大；并通过激活DNAzyme催化DNA探针A的裂解，释放出第一信号分子，使得第一信号分子的信号强度降低，DNA探针A裂解后形成的游离的探针序列进一步激活其他DNAzyme，从而放大信号；最后通过电化学检测方法分析第一信号分子和第二信号分子的信号强度的变化，实现目标ctDNA的定量检测。

2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，所述第一信号分子为二茂铁，所述第二信号分子为亚甲基蓝。

3.根据权利要求2所述的基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，其中，通过向反应体系中加入辅酶因子来激活DNAzyme。

4.根据权利要求3所述的基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，其中，辅酶因子为Mg²⁺。

5.根据权利要求4所述的基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

1)金电极预处理；

2)DNA探针A的修饰：先配制电极固定液，再使用该电极固定液配制DNA探针A溶液，然后将预处理后的金电极插入DNA探针A溶液中修饰，之后洗净金电极，然后在巯基己醇中浸泡反应；

3)目标ctDNA定量分析：分别配制DNA探针B溶液和与DNA探针C溶液，然后混合，得到的混合液先加热然后冷却至室温；将步骤2)得到的金电极浸泡到该混合液中反应，接着将金电极洗净后浸泡到待测得目标ctDNA溶液中反应，随后向目标ctDNA溶液中加入Mg²⁺，继续反应；

对步骤3)反应前后的金电极进行电化学分析，通过预先制定的表征目标ctDNA浓度与金电极的电化学信号的强度变化关系的标准曲线计算得到目标ctDNA的浓度。

6.根据权利要求5所述的基于DNAzyme循环激活的循环肿瘤DNA检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

1)金电极预处理；

2)DNA探针A的修饰：先配制pH为7.4的电极固定液，该固定液包括：10mM Tris-HCl、1mMEDTA、10mM TCEP和0.1M NaCl，再使用该电极固定液配制浓度为0.8μM的DNA探针A溶液，然后将预处理后的金电极插入DNA探针A溶液中修饰8小时，之后洗净金电极，然后在巯基己醇中浸泡反应0.5小时；

3)目标ctDNA定量分析：分别配置浓度均为2μM的DNA探针B溶液和与DNA探针C溶液，然后等体积混合，得到的混合液先加热到95℃，5分钟后冷却至室温；将步骤2)得到的金电极浸泡到该混合液中反应1小时，接着将金电极使用双蒸水洗净后浸泡到待测得目标ctDNA溶液中反应1小时，随后向目标ctDNA溶液中加入35mM Mg²⁺，继续反应1小时；

对步骤3)反应后的金电极进行电化学分析，通过预先制定的表征目标ctDNA浓度与金电极的电化学信号的强度变化关系的标准曲线计算得到目标ctDNA的浓度。