[发明专利]高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒重组菌，共表达芳香醛合酶基因AAS、胺氧化酶基因Mao以及醛脱氢酶基因Glox，将构建好的表达质粒导入大肠杆菌中构建得到重组细胞。再通过氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性组合平板筛选获得高效生产戊二酸的重组菌株。并通过优化底物浓度、菌体浓度，以及转化温度，实现了戊二酸的高效生产。在菌体浓度为30g/L、pH为8，并额外添加6mM NADsupgt;+/supgt;的转化条件下反应30h，可将30g/L的L‑赖氨酸转化为19.65g的戊二酸，转化率可达到65.3％。

技术领域

本发明涉及一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

戊二酸(Glutarate)，俗名胶酸，是一种脂肪族二元羧酸，分子式是C₅H₈O₄，分子量132.11，常温下为无色针状结晶固体，易溶于水、乙醇、乙醚等，在水中溶解度可达430 g/L。在所有二元羧酸中，戊二酸的熔点最低，为95-98℃，这一良好的特性使其更适合用于尼龙-4 ,5和尼龙-5 ,5等聚酯和聚酰胺的生产。此外，戊二酸也是1,5-戊二醇的前体，1,5-戊二醇是用作助焊剂、活化剂以及重要药物中间体的常用增塑剂。总之，戊二酸作为一种重要的C5平台化合物，在药物和化工合成等领域均具有重要的应用价值和发展潜力。

目前，戊二酸的主要合成方式是化学合成法，其中工业生产主要是在硝酸催化下，从氧化环己酮和环己醇的混合物中回收利用，在实验室水平也可完成较少剂量的制备工作，比如可以分别以γ-丁内酯、二氢吡喃、戊二腈、环己酮等物质作为底物，通过一系列化学反应制备而得到。然而通过传统化学法合成戊二酸具有成本高、污染严重、操作条件要求高等缺点，因此，寻找相对环保的生物法合成戊二酸，对环境保护和高效生产以及未来戊二酸的生产前景都具有深远的意义。

近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产戊二酸进行了探索研究。到目前为止，文献报道过的戊二酸的生物合成途径主要有以下四种，分别是：戊烯二酸还原途径、碳链延长与脱羧途径、反己二酸降解途径以及赖氨酸降解途径(包括以戊二胺为中间体的降解途径和以5-氨基戊酸为中间体的降解途径)。上述所有路径涉及的路径酶过多，路径过于复杂。因此，进一步构建全新且最简路径并提高戊二酸产量成为亟待解决的问题，同时也是当前世界各国科研人员关注的焦点之一。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种全新的生产戊二酸的路径，并通过构建单酶表达菌株验证了其有效性。并进一步提供了一种高效生产戊二酸的重组大肠杆菌工程菌，通过构建双质粒表达系统，将编码芳香醛合酶的基因AAS和编码胺氧化酶的基因Mao及编码醛脱氢酶的基因Glox共表达于大肠杆菌宿主中构建得到重组菌，以构建得到的重组菌为催化剂，以L-赖氨酸为底物，催化合成戊二酸，并对其中的反应条件进行了优化。

本发明的第一个目的是提供一种生产戊二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主中表达芳香醛合酶AAS、胺氧化酶Mao以及醛脱氢酶Glox。

在本发明中，构建的具体的代谢反应路径是通过芳香醛合酶AAS将L-赖氨酸转化为5-氨基戊醛，再通过胺氧化酶Mao将5-氨基戊醛转化为戊二醛，最后通过醛脱氢酶Glox将戊二醛转化为戊二酸。

进一步地，所述的芳香醛合酶基因AAS、胺氧化酶基因Mao以及醛脱氢酶基因Glox通过双质粒表达系统进行表达。

进一步地，芳香醛合酶基因和胺氧化酶基因通过同一质粒进行表达。

进一步地，所述的双质粒表达系统为pETM6R1质粒、pET28a质粒、PRSF质粒、pCOR质粒、pCDF质粒和PACYC质粒中的两种组合。

在本发明中，一种具体的实例是：pETM6R1质粒用于表达芳香醛合酶基因AAS、胺氧化酶基因Mao，pET28a质粒用于表达醛脱氢酶基因Glox。