[发明专利]耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过利用易错PCR方法来构建突变体文库，对Bacillus licheniformis WX‑02来源的蛋白酶基因进行突变，再通过高通量筛选，获得了蛋白酶突变体BLAPR5、BLAPR6、BLAPR7、BLAPR8、BLAPR9、BLAPR10、BLAPR11、BLAPR12，与野生型蛋白酶相比，其酶活分别提高了36.0％、65.5％、35.2％、55.5％、49.0％、84.0％、45.5％、76.0％，因此耐热性得到了显著提升，有利于在饲料、食品等多领域的使用，具有良好的市场应用前景和工业价值。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，有着许多不同的生理功能。蛋白酶在各个领域中被广泛应用，例如食品工业、酿酒酿造、洗涤剂行业、饲料工业、制革工业、丝绸行业和医药行业等，所以，这种环境下对蛋白酶的产量和特性改良方面都提出了更高的要求。

目前市场上大多数蛋白酶经70℃处理后仅剩余不到20%的酶活，且总体耐温性能差，限制了蛋白酶的广泛使用。例如在饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活。因此，提高蛋白酶的耐热性至关重要。

易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件，增加扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，从而筛选需要的正向突变体。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

发明内容

本发明提供了耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。通过易错PCR方法构建突变体文库和定向筛选，对Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因进行改良，筛选得到多种耐热性提高的突变体，有助于提升其在饲料、食品等领域中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了耐热性提高的蛋白酶突变体BLAPR5，所述蛋白酶突变体BLAPR5的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述蛋白酶突变体BLAPR5是由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第183位的苏氨酸变为谷氨酸获得的。

本发明还提供了耐热性提高的蛋白酶突变体BLAPR6，所述蛋白酶突变体BLAPR6的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述蛋白酶突变体BLAPR6是由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第183位的苏氨酸变为谷氨酸和第106位的丙氨酸变为天冬氨酸获得的。

本发明还提供了耐热性提高的蛋白酶突变体BLAPR7，所述蛋白酶突变体BLAPR7的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述蛋白酶突变体BLAPR7是由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第183位的苏氨酸变为谷氨酸和第120位的赖氨酸变为脯氨酸获得的。

本发明还提供了耐热性提高的蛋白酶突变体BLAPR8，所述蛋白酶突变体BLAPR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述蛋白酶突变体BLAPR8是由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第183位的苏氨酸变为谷氨酸和第176位的缬氨酸变为丙氨酸获得的。