[发明专利]用于HLA-DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法

说明书

本申请公开了一种用于HLA‑DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法,其属于生物医药工程的技术领域，其中用于HLA‑DR*13基因检测的引物组及其相应探针包括根据HLA‑DR*13等位基因特异性设计的引物组和探针，引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：2所示的反向引物；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或其互补序列。本申请具有缩短HLA‑DR*13基因检测的时间，提高检测效率，对HLA‑DR*13基因进行高通量检测的效果。

技术领域

本申请涉生物医药工程的技术领域，尤其是涉及一种用于HLA-DR*13基因检测的引物组、探针、试剂盒及其方法。

背景技术

人类白细胞抗原(HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)的表达产物，分布于白细胞表面和全身组织细胞，其决定了机体的组织相容性，是由人体6号染色体上的一组基因调控表达的。HLA的化学本质为一类糖蛋白，由一条被糖基化的α重链和一条β轻链非共价结合而成，其肽链的氨基端向外，羧基端穿入细胞质中，中间疏水部分位于胞膜中。

HLA作为人体组织细胞的遗传标志，特别是位于免疫细胞上的HLA具有向抗原特异性T细胞受体(TCR)传递抗原多态性的生物学特性，在抗原识别、免疫应答以及免疫调控等方面起到重要作用。HLA是人体内首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统，是目前已知最复杂的人类基因复合体，根据功能可将其分为Ⅰ、Ⅱ以及Ⅲ类基因。

其中，Ⅱ类抗原是CD4分子的配体，参与T细胞应答、免疫应答的遗传控制、约束免疫细胞间的相互作用、抗原呈递、免疫调节以及免疫细胞分化等过程。在已知HLA的Ⅱ类抗原中HLA-DRB多态性最为复杂，该类抗原的基因编码区中已经发现了227个以上的等位基因，人体免疫应答基因位于该类抗原的基因编码区内，人体免疫应答强弱受到HLA-DR基因的控制。最近的研究中发现，HLA-DR基因与慢性重型乙肝肝炎发病进程有密切的关系。

慢性乙肝肝炎是指乙肝病毒(HBV)检测呈阳性，病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现者，其临床表现为乏力、畏食、恶心以及肝区疼痛等症状；其中，慢性重症乙肝肝炎是乙型肝炎常见的致命原因。

人体受到HBV感染后，免疫系统被激活发生免疫应答反应，但是由于机体内免疫应答反应过强，导致免疫系统攻击自身的肝细胞，导致肝细胞大量坏死和凋亡，导致肝功能衰竭；并且在这过程中，机体的内环境发生改变，使得肠粘膜屏障功能下降，肝脏Kupffer细胞吞噬功能下降，导致体内内毒素增多，激活Kupffer细胞释放出细胞因子以及炎症递质等物质，进而引发肝循环障碍，对肝脏造成二次打击，使得肝损伤持续存在，并且不断加重，最终导致慢性重症乙肝肝炎的发生。

研究认为，人体感染HBV之后病程的发展主要取决于个体的免疫应答状况，而病毒特异性的T细胞反应对HBV病毒的清除起着关键作用，尤其是HLA-DR限制性的特异性CD4+T细胞，其诱导HBV病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的发生，且辅助B淋巴细胞产生针对HVB外膜和核衣壳的抗原。其中，HLA-DR13能比其他HLA-DR呈递更多的HBV抗原决定簇，因而能诱导机体发生更强烈的HVB病毒特异性的CD4+T细胞反应，使得机体免疫应答过强导致肝组织细胞的大量坏死和凋亡，导致慢性重症乙肝肝炎的发生。HLA-DR13基因与乙型慢性肝炎基础上法还是能的重症肝炎有密切关系，是一个对判断病情以及预测病程发展有价值的指标。

目前，HLA-DR*13基因检测方法主要有Sanger测序法，其利用ddNTP的3’端不含有羟基无法形成磷酸二酯键导致DNA合成中断的原理。在Sanger测序法的过程中，利用一种DNA聚合酶来延伸结合在特定序列模板上的引物，当合成进行到一定程度上后，往反应体系中加入一种荧光标记的ddNTP，产生以不同核苷酸结束的多组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测。使用Sanger测序法进行HLA-DR*13基因检测具有较高的准确性，但是，Sanger测序法的操作较为繁琐，所需要的时间较长，不适合高通量的检测。

发明内容