[发明专利]基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒有效
| 申请号： | 202111393430.0 | 申请日： | 2021-11-23 |
| 公开（公告）号： | CN114085917B | 公开（公告）日： | 2023-08-15 |
| 发明（设计）人： | 陈利民;石耀强;徐敏;李玉佳;杨春晖;段晓琼;李世林 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院输血研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01 |
| 代理公司： | 成都方圆聿联专利代理事务所(普通合伙) 51241 | 代理人： | 王悦 |
| 地址： | 610051 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 crispr cas12a lamp 快速 可视化 检测 福氏志贺氏菌 方法 试剂盒 | ||
【说明书】：
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a‑LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒，本发明通过对LAMP的扩增方法与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为CRISPR/Cas12a‑LAMP的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对福氏志贺氏菌的分子检测技术在基层中的推广和应用。
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a-LAMP快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒。
背景技术
由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas蛋白)组成的CRISPR/Cas系统被认为是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种适应性免疫系统，以消灭外来的遗传物质。 CRISPR序列是一个特殊的DNA重复序列，包含有高度保守的长度约为21-48bp的重复序列(repeats)和26-72bp的间隔序列(spacer)。重复序列被不同的间隔序列隔开，CRISPR通过间隔序列对靶基因进行识别。Cas位于CRISPR位点附近，是双链DNA核酸酶家族的总称。随着对CRISPR/Cas系统的作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示，CRISPR/Cas系统逐渐发展成为一种由引导RNA指引Cas核酸酶对靶基因进行特定核酸编辑的技术。CRISPR/Cas系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶如Cas9蛋白至与crRNA配对的靶序列位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。故CRISPR/Cas系统不仅可以应用于基因编辑，而且已经成为核酸检测的一种工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。目前已鉴定出很多种Cas蛋白能在sgRNA引导下对靶位点进行切割。Cas12a属于该家族中的一种，能在sgRNA引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的Cas12a可发挥非特异性剪切酶活性，对所遇到的单链DNA(ssDNA) 进行非特异性剪切。利用Cas12a可被靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。
相比较于传统病原体的鉴定方法，核酸检测技术是早期诊断的利器。尽管qPCR作为核酸检测金标准已经广泛应用于一线检测中，但是基于变温扩增的检测技术需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，难以满足即时检测要求，对于病原体含量极低的情况无法实现早期监测。如何更加快速、简便、准确、低成本的检测，是病原体核酸检测未来的发展方向。现有的一些核酸快速检测方法有LAMP(环介导等温扩增) 以及RPA-exo探针法(重组酶聚合酶扩增-探针法)等。这类方法在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，摆脱了对变温设备的依赖，靶标核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于 LAMP或RAA的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是其高速扩增和高灵敏度带来了假阳性的可能。基于CRISPR/Cas系统的恒温检测则在恒温扩增方法的基础上引入了高度精确的CRISPR系统，极大提高了检测方法的精确度与灵敏度。
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- 2023-09-12 - 2023-10-20 - C12Q1/689
- 本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种基于舌拭子的结核分支杆菌检测方法及试剂盒。本发明提供了用于实时荧光定量PCR检测结核分支杆菌的2组引物探针组合，分别针对IS6110序列和IS1081序列。本发明提供的试剂盒适用于舌拭子，并对核酸提取试剂和扩增反应试剂进行了优化，灵敏度和特异性高，能有效实现对样品的定性定量检测，极大的降低了结核的漏诊率。
- 一种用于检测大熊猫三种致病菌的引物组合、试剂盒及其检测方法-202311049793.1
- 苏小艳;刘颂蕊;燕霞;刘圣;曹立亭;杨梅;岳婵娟;范雪阳;李运莉;张东升;李林;张洪文 - 成都大熊猫繁育研究基地
- 2023-08-18 - 2023-10-20 - C12Q1/689
- 本发明公开了一种用于检测大熊猫三种致病菌的引物组合、试剂盒及其检测方法。其中，引物序列如SEQ ID NO.1～6所示。本发明建立的多重PCR检测方法具有良好特异性、灵敏性和抗干扰性，检出率优于病原分离鉴定法，极大的提高了检出效率，可为大熊猫种群三种细菌性疾病感染的快速诊断及流行病学调查提供技术支持，具有重要的临床意义。
- 一种斑疹伤寒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒-202210533343.9
- 肖利力;贾欣月;刘翌;康洁;金鑫浩;蔡亦梅;张瑜;高静;范东雨;任鲁风 - 北京中科生仪科技有限公司;北京璘客生物科技有限公司
- 2022-05-13 - 2023-10-20 - C12Q1/689
- 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种斑疹伤寒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明提供的引物探针组合物检测斑疹伤寒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。本发明利用一体化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进‑结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。
- 一种鼠疫耶尔森菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒-202210543236.4
- 康洁;刘建礼;贾欣月;金鑫浩;张瑜;高静;蔡亦梅;范东雨;任鲁风 - 北京中科生仪科技有限公司;北京璘客生物科技有限公司
- 2022-05-13 - 2023-10-20 - C12Q1/689
- 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种鼠疫耶尔森菌检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明提供的引物探针组合物检测鼠疫耶尔森菌，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。本发明利用微流控芯片技术，通过集核酸提取、纯化、扩增和检测为一体的方式，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进‑结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，纯化加扩增，60分钟内出结果。
- 检测不同生殖道病原体的组合物、试剂盒、方法及其用途-202310786516.2
- 向丽蓉;张萌;任小梅;吴康;戴立忠 - 圣湘生物科技股份有限公司
- 2023-06-29 - 2023-10-20 - C12Q1/689
- 本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及生殖道感染相关病原菌的检测，更具体地，涉及微小脲原体、大肠杆菌、粪肠球菌和乳杆菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现微小脲原体、大肠杆菌、粪肠球菌和乳杆菌的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
- 专利分类
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