[发明专利]一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病毒三重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于，由单纯疱疹病毒1型UL49基因的上游引物HSV-1-UL49F、下游引物HSV-1-UL49R和探针HSV-1-UL49P，单纯疱疹病毒2型gG基因的上游引物HSV-2-gGF、下游引物HSV-2-gGR和探针HSV-2-gGP，伪狂犬病毒UL24基因的上游引物PRV-UL24F、下游引物PRV-UL24R和探针PRV-UL24P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物HSV-1-UL49F：GGTTCCGCGCGATGAG；

下游引物HSV-1-UL49R：GGGACTCGCCATACATGAAGA；

探针HSV-1-UL49P：VIC-ACGAGGATCTGTACTACAC-MGB；

上游引物HSV-2-gGF：CTACCACGCGTCGCTTTTG；

下游引物HSV-2-gGR：ATAAACGTGCGGCCCGTAA；

探针HSV-2-gGP：FAM-TCCCCAGAGCCTGCT-MGB；

上游引物PRV-UL24F：CTTCCCCGAGAGACGCTTAA；

下游引物PRV-UL24R：CCCGAGGTTGACTTCAAAGG；

探针PRV-UL24P：CY5-AAGGCGTCCTTGACC-MGB。

2.一种包含权利要求1所述的检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，由试剂A、试剂B和试剂C组成；试剂A为荧光定量PCR反应预混液，包含探针法FastFire快速定量PCR试剂、内参染料ROX Reference Dye、权利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的三组引物、探针和无菌无酶水；试剂B为阳性对照，包含标准质粒对照品pUC57-UL49、pUC57-gG和pUC57-UL24；试剂C为阴性对照，为Tris-EDTA缓冲液。

4.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒对照品pUC57-UL49，浓度为5.0×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-gG，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升；标准质粒对照品pUC57-UL24，浓度为4.3×10⁴拷贝/微升。

5.一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(2)采用权利要求1所述的检测组合物建立三重荧光定量PCR反应体系；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

6.如权利要求5所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂A和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照标准品或阴性对照标准品。

7.如权利要求6所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述20μL的试剂A包括探针法FastFire快速定量PCR试剂12.5μL、内参染料ROX Reference Dye 0.25μL、权利要求1所述的HSV-1-UL49、HSV-2-gG和PRV-UL24基因的6种引物的反应终浓度均为0.2μM、3种探针的反应终浓度均为0.15μM，余量为无菌无酶水。

8.如权利要求7所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为98℃预变性60s，98℃变性5s，60℃退火15s，40个循环。