[发明专利]一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法

说明书

一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明公开了一株过表达Are2和Yft2基因的同时替换SEI1及Tgl1基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母由原始酿酒酵母利用同源重组技术替换基因后改造而成。由于原始菌株BY4741自身存储甾醇类物质的量有限，并且过量积累的脂质中间体会产生产物抑制作用，不仅直接影响目标产物的合成，而且会引发细胞毒性，降低细胞活力。改造后的耐油酿酒酵母基因工程菌较原始出发菌株显著提升了细胞油脂存储单元脂滴结构的体积占比，有效地降低了脂质累积引起的细胞毒性和产物抑制，显著提升了酯类化合物的胞内累积量，为突破酯类类化合物酿酒酵母从头合成极限提供了新的策略以及良好的耐受细胞模型。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法。

背景技术

脂类化合物是一种多样且普遍存在的化合物，如脂肪酸、磷脂、甾醇、鞘脂、萜烯等，具有许多关键的生物学功能，参与细胞膜的结构组成、能量的储存和信号转导等过程，是医药、食品及大宗化学品的代表性产品。

酿酒酵母具有较为完备的遗传操作优势、分子信息的高获得性、传代时间短、易于培养和对有机溶剂的高耐受性，经常被用作通过代谢工程生产高价值药物的重要底盘。通过强化脂肪酸合成途径，实现在酿酒酵母细胞底盘的脂肪醇、脂肪酸及其衍生物的高效合成，从而搭建油脂平台化合物的从头合成的新途径。此外，酿酒酵母具有内源性的甲羟戊酸途径，能够稳定提供前体异戊烯焦磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯和2,3-环氧角鲨烯，其完整内膜系统和翻译后修饰有利于环化酶和P450酶的活性表达，借助其完善的遗传操作平台，已成为萜类化合物、黄酮类化合物等多种输水性酯类化合物从头合成的重要底盘，以构建了包括紫杉二烯、青蒿酸，法呢烯、α-檀香烯、人参皂甙、香叶醇等多种天然产物的从头合成路径。由此可见，酿酒酵母作为酯类化合物从头的合成底盘，具有重要的开发及应用潜力。

在酿酒酵母发酵生产酯类化合物的反应体系中，廉价的油酸作为油脂合成前体，是替代葡萄糖等简单碳源促进酯类化合物细胞合成的重要碳源替代物。此外，在输水性油脂化合物发酵合成路线中，油-水两相反应体系的应用不但能够及时富集产物在油相的累积，减轻水相细胞中的产物抑制效应，也同时能够简化后续产品的分离提取，是一种理想的微生物发酵体系。但大部分野生型酿酒酵母在油酸培养基生长条件下呈现生物量明显降低，细胞耐受差等表型，不利于油酸碳源的有效利用及脂质化合物的高效转化。因此，利用基因工程改造技术获得油脂耐受性较高的酿酒酵母菌对提升脂质化合物的从头合成及廉价碳源利用具有重要意义。

脂质的合成、运输、储存和其他过程都受到酿酒酵母内膜系统的动态和精确调节，是最终影响产量的关键因素。由于细胞内空间有限，单纯提高关键限速酶的活性无法彻底突破细胞脂质合成和储存的限制。近年来，细胞器的理性改造技术已成为除了强化目标产物代谢通量之外的另一种合理强化策略。其中，脂滴作为酵母细胞脂质储存最重要的细胞器，以中性脂质为核心，由单层磷脂包裹，允许细胞将非极性分子储存在特定的隔间中，实现非极性分子与细胞的水环境的隔离。脂滴结构的修饰和储存的加强有效地降低了脂质积累引起的细胞毒性和产物抑制，使细胞突破了脂质合成的极限。因此，如何通过定向的基因工程改造提升细胞脂滴存储单元，减轻细胞内脂质积累和提高单细胞的脂质存储量效率对强化输水性酯类化合物在酿酒酵母细胞的高效合成尤为重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法的技术方案。

本发明第一方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌。