[发明专利]一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于该基因工程菌通过原始酿酒酵母过表达Are2和Yft2基因，同时靶向敲除SEI1及Tgl1基因后获得。

2.如权利要求1所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述Are2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Yft2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述原始酿酒酵母为BY4741。

4.如权利要求1-3任一所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取原始酿酒酵母的基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在SEI1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、G418抗性基因序列、Are2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到SEI1::Are2基因替换组件；

(3)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在Tgl1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、hph抗性基因序列、Yft2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到Tgl1::Yft2基因替换组件；

(4)将步骤(2)和(3)得到的SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换的酿酒酵母基因工程菌。

5.如权利要求4所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(2)中Are2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

6.如权利要求4所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(2)中SEI1::Are2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求4所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(3)中Yft2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

8.如权利要求4所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(3)中Tgl1::Yft2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.如权利要求4所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(4)中利用含有500ug/mLG418和500ug/mLhph的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到SEI1::Are2和Tgl1::Yft2双基因替换的酿酒酵母基因工程菌。

10.如权利要求1-3任一所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌在提升酿酒酵母耐油性中的应用。