[发明专利]基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法

说明书

本发明涉及基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法，属于PCR检测技术领域。本发明提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述方法为先提取样本中的病毒DNA，再以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析；所述方法基于ddPCR，ddPCR可对核酸分子进行绝对定量且灵敏度高，同时，ddPCR无需标准品，变量少，准确度更高，检测下限更低，更适合拷贝数低的痘苗病毒lister株定量测定，因此，使用所述方法定量测定样本中痘苗病毒lister株具有灵敏度高、准确性高且检测下限低的优势。

技术领域

本发明涉及基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法，属于PCR检测技术领域。

背景技术

痘苗病毒(vaccinia virus)属痘病毒(Poxvirus)，在血清学和免疫学上与天花病毒及牛痘病毒有密切关系。过去，痘苗病毒一直被用作预防天花的疫苗。随着分子生物学的发展，人们又发现了它的新价值——基因工程的有利载体。

痘苗病毒的改造是在痘苗病毒lister株(野生型)的原始TK片段中，删除特异性片段并插入外源目的片段。痘苗病毒的TK基因编码胸苷激酶，在TK基因中删除特异性片段并插入外源目的片段的改造痘苗病毒毒力较痘苗病毒lister株明显下降，因此，改造痘苗病毒在作为基因工程的有利载体中极具应用前景。

为了更好的发挥其载体功能，在痘苗病毒的改造中尽可能的减少其痘苗病毒lister株含量十分关键，相应的，高灵敏度的检测改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株含量的方法必不可少。

目前，对于改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株含量的测定方法主要包括普通PCR或qPCR。其中，普通PCR检测灵敏度不够，无法定量，仅能定性检测改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的含量，无法得知痘苗病毒lister株在改造痘苗病毒中的占比；qPCR虽然能定量检测，但检测下限较高，对于痘苗病毒lister株含量极少的情况下，不足以准确定量，影响实验结果，同时，qPCR的检测结果准确性依赖于标准品定量，标准品浓度的准确度、稀释标准品操作的正确性都影响qPCR结果的准确性。

因此，亟需找到灵敏度高、准确性高且检测下限低的定量测定改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株的原始TK片段中，删除特异性片段并插入目的片段获得的，所述方法包括如下步骤：

提取步骤：提取样本中的病毒DNA；

检测步骤：以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；

所述ddPCR采用的上游引物和下游引物能够特异性扩增原始TK片段以及删除特异性片段并插入目的片段后的TK片段。

在本发明的一种实施方式中，所述特异性片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

在本发明的一种实施方式中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

在本发明的一种实施方式中，所述ddPCR的反应体系包含ddPCR Supermix forprobes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template 9.9μL以及H₂O0.154μL。

在本发明的一种实施方式中，所述原始TK片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。