[发明专利]一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种卤醇脱卤酶突变体以及合成抗真菌药物关键手性环氧中间体的应用。本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及一种立体选择性翻转的卤醇脱卤酶突变体N176G，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。该卤醇脱卤酶突变体可应用于催化化合物I不对称脱卤合成手性环氧化物II，分离收率为80％，光学纯度高达98％ee。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种卤醇脱卤酶突变体及其应用。

背景技术

近20年来，随着免疫缺陷患者增多、器官移植和介入性诊断与治疗的广泛开展、以及抗菌药物和化疗药物的广泛应用，真菌感染的发生率正逐年上升。真菌感染严重威胁人类的健康生活，对于免疫系统遭到破坏的病人来说，真菌感染尤为严重。目前临床使用的抗真菌药物主要有多烯类、三唑类、咪唑类、棘白菌素类、吗啉类以及氟胞嘧啶等。以氟康唑为代表的三唑类抗真菌药物的作用机制为选择性抑制真菌甾醇-14α-去甲基酶，使细胞膜麦角固醇合成受阻。此外甾醇-14-去甲基酶受抑，14α-甲基甾醇在真菌细胞内浓集而损伤真菌的一些酶(如ATP酶、电子转运有关的酶)的功能。基于以上作用机制，达到治疗真菌感染的目的。

三唑类抗真菌药物对真菌的抗菌谱广，对浅部真菌和深部真菌均有效，很少产生耐药性。与咪唑类抗真菌药物相比，三唑类抗真菌药物对真菌细胞色素P450酶的选择性较咪唑类高，对人的毒性作用较小，疗效较好。如最新上市的三唑类抗真菌药艾沙康唑(isavuconazonium)是由安斯泰来制药公司(Astellas)和巴塞利亚制药公司(Basilea)联合开发，于2015年3月6日被美国FDA批准上市，用于成人侵袭性曲霉菌病和毛霉菌病感染的治疗，在欧盟和美国，艾沙康唑均被授予孤儿药地位。除此之外，其他已上市的三唑类抗真菌药物还有雷夫康唑(Ravuconazole)、伏立康唑(Voriconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)、泊沙康唑(Posaconazole)等。

手性环氧化合物II是合成手性三唑类抗真菌药物的关键手性中间体。目前化合物II的合成主要是通过动力学拆分获得，理论收率低，合成工艺涉及的反应步骤冗长，分离纯化过程复杂(Tetrahedron Lett.2001,42:3331–3333；Tetrahedron,2004,60:601-605；Chin.J.Chem.2013,31:1139—1143)。因此，针对三唑类抗真菌药物的关键手性中间体化合物II的合成，开发高效、绿色和简便的制备工艺对于发展药物绿色制造技术以及新型三唑类抗真菌药物的研发具有重要的应用价值。

发明内容

本发明意在提供一种卤醇脱卤酶突变体以及该突变体催化前手性化合物I不对称合成手性环氧化合物II的应用。

一种卤醇脱卤酶突变体N176G，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本方案中的一种卤醇脱卤酶突变体N176G是在来源于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)卤醇脱卤酶(核苷酸序列如序列SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示)为亲本酶，利用其基因的表达质粒为模板，设计并合成对应的PCR引物，利用点饱和突变技术，构建突变文库，结合筛选方法，获得立体选择性逐步翻转的优良突变体。经过三轮突变与筛选，最终获得卤醇脱卤酶突变体N176G。具体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位天冬氨酸突变为甘氨酸既得卤醇脱卤酶突变体N176G。

本申请文本中所用的术语“卤醇脱卤酶突变体N176G”是指一种以SEQ ID No:2所示氨基酸序列为参考序列，将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第176位的天冬酰胺突变为甘氨酸。

本发明所述的卤醇脱卤酶突变体N176G可以以工程菌全细胞形式使用。如果需要，也可以是经部分纯化或完全纯化的酶的形式使用，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体N176G制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。