[发明专利]一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌，是通过将酿酒酵母菌中的GAL4启动子替换为铜离子抑制启动子pCTR1或pCTR3，将GAL80启动子替换为铜离子诱导启动子pCUP1构建而成，该工程菌在种子培养期，受铜离子作用会抑制GAL基因调控系统中控制外源基因的pGAL1，pGAL2，pGAL7和pGAL10启动子的表达，避免了产物过早生产，显著提高了传代稳定性。而且该工程菌的GAL基因调控系统不受半乳糖浓度的影响，提高了萜类化合物生物表达，其构建方法简单，生产成本低，发酵生产阶段，无需添加任何诱导剂即可实现目标产物的生产，适合大规模生产，该工程菌在萜类化合物的生产领域有着巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟，酿酒酵母被广泛地应用于生物类产品、高附加值天然产物及饲料的添加剂的生产。但生产过程中基因过早的泄露表达，会导致外源代谢途径中间产物和蛋白的积累，对宿主细胞造成毒害作用，菌株出于自我保护机制，会通过基因突变的方式将外源基因去除掉，出现所谓的菌株退化，进而生产效率大大降低。因此避免目的基因过早泄露表达是构建酿酒酵母工程菌过程中必须考虑的。

酿酒酵母自身内源的GAL调控系统，是通过GAL4和GAL480蛋白影响着 GAL基因的转录与表达，其中GAL4是转录调节相关的蛋白，GAL4蛋白的表达受SNF1网络和GAL80蛋白的调控，当存在葡萄糖时，SNF1抑制GAL4蛋白的表达从而导致GAL基因不表达；当不存在葡萄糖时，且不存在半乳糖，GAL4 蛋白被GAL80蛋白结合，使得GAL40蛋白不能结合GAL基因的启动子区；当存在半乳糖时，GAL3与GAL80竞争性结合半乳糖，从而释放GAL4蛋白，最终使得GAL基因的启动子起作用。因此在诱导阶段需要添加半乳糖，但是半乳糖昂贵，不利于工业生产成本的降低。如果敲除GAL80基因，GAL基因的启动子受葡萄糖控制，在高葡萄糖浓度时抑制，低葡萄糖浓度启动。酿酒酵母的生长又与培养基中的葡萄糖含量息息相关，会增加调控的复杂性，经常出现目的基因提前泄露表达，导致菌株退化。也有将GAL调控系统改成GAL启动子受铜离子诱导启动的，在生产生时添加铜离子诱导目的基因表达，但在培养过程中添加过量铜离子不符合食品安全的要求，也增加了污水处理的成本。

因此，构建一套遗传稳定且不需要额外添加其他诱导剂的基因调控系统，对于酿酒酵母工程菌的构建显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供的一种酿酒酵母基因工程菌，在所述酿酒酵母基因工程菌的 GAL基因调控系统中，GAL4的启动子包括pCTR1或者pCTR3中的任一种， GAL80的启动子包括pCUP1；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述pCTR3的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

进一步的，所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80 的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQ NO.5所示。

进一步的，在一定铜离子浓度下，所述GAL基因调控系统中控制外源基因表达的启动子pGAL1，pGAL2，pGAL7或者pGAL10被抑制表达。

本发明还提供了上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

步骤S1，构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；

步骤S2，构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；