[发明专利]一种酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在所述酿酒酵母基因工程菌的GAL基因调控系统中，GAL4的启动子包括pCTR1或者pCTR3中的任一种，GAL80的启动子包括为pCUP1；所述pCTR1的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；所述pCTR3的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

2.如权利要求1所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：所述pCTR1或者pCTR3替换的GAL4的启动子为GAL4基因起始密码子前456bp，核苷酸序列如SEQ NO.4所示；所述pCUP1替换的GAL80的启动子为GAL80基因起始密码子前426bp，核苷酸序列如SEQ NO.5所示。

3.如权利要求2所述的一种酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：在一定铜离子浓度下，所述GAL基因调控系统中控制外源基因表达的启动子pGAL1，pGAL2，pGAL7或者pGAL10被抑制表达。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤

S1、构建含启动子pCTR1的GAL4模块重组质粒pCuZ100，或者构建含启动子pCTR3的GAL4模块重组质粒pCuZ101；

S2、构建含启动子pCUP1的GAL80模块重组质粒pCuZ102；

S3、将步骤S1和步骤S2所得的重组质粒转入宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR1和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；或者通过菌落PCR获取GAL4的启动子为pCTR3和GAL80的启动子为pCUP1的阳性菌落；即得到酿酒酵母基因工程菌。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS-A3中的任一种；所述GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为.CCTCC NO:M20211191。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：构建重组质粒pCuZ100的方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pGAL4-left-F和pGAL4-left-R、pCTR1-F和pCTR1-R、pGAL4-right-F和pGAL4-right-R引物进行PCR反应，获得DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right；

S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-1-F和G418-1-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418-1；

S3、将步骤S1获得的DNA片段pGAL4-left、pCTR1和pGAL4-right和步骤S2获得的表达盒G418-1，通过用引物pGAL4left-F和pGAL4-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCTR1；

S4、将步骤S4获得的DNA片段G418_pCTR1与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，记为pCuZ100。