[发明专利]基于大肠杆菌素E家族DNA酶的蛋白质复合物及其在人工蛋白支架中的应用

说明书

本发明公开了基于大肠杆菌素E家族DNA酶的蛋白质复合物及其在人工蛋白支架中的应用，所述蛋白质复合物中包括：CL2蛋白与Im2蛋白形成的相互作用对，或CL7蛋白与Im7蛋白形成的相互作用对，或CL8蛋白与Im8蛋白形成的相互作用对，或CL9蛋白与Im9蛋白形成的相互作用对中的任意一种或多种。本发明通过对CE家族的DNA酶CE2、CE7、CE8和CE9的羧基端DNase结构域进行蛋白质工程改造，获得丧失DNA酶活性，但仍保留有与对应的免疫蛋白Im具有超高亲和力的突变体，并构建得到了CL2/Im2，CL7/Im7，CL8/Im8和CL9/Im9蛋白质相互作用对。研究发现这些蛋白质相互作用对具有耐热性，高亲和力，高特异性，分子量小，组装速度快等性质，基于此构建了人工蛋白质支架，为人工多酶复合物的构建搭建了新型平台。

技术领域

本发明属于合成生物学及纳米生物技术领域，具体涉及基于大肠杆菌素E家族DNA酶的蛋白质复合物及其在人工蛋白支架中的应用。

背景技术

高亲和力的蛋白质相互作用对在许多领域都有广泛的应用，如免疫共沉淀、蛋白质pull-down、酵母双杂交和酶的固定化等，其中利用蛋白质相互作用对自组装形成的多酶复合物体系因具备出色的协同催化能力而备受关注。对于“一锅法”合成反应而言，利用多个有着正交性的蛋白质相互作用对实现多个酶分子按照特定的顺序进行组装，以人工多酶复合物的形式进行级联催化反应，有利于底物通道的形成，可以防止中间产物的扩散，促进中间产物及时转化，从而避免某些有毒中间体对酶活性的干扰，提高反应效率。目前，蛋白质-蛋白质的相互作用主要通过来源于纤维小体的基本组装元件Cohesin-Dockerin以及人工设计的SpyCatcher/SpyTag、SnoopCatcher/SnoopTag和RIAD/RIDD等蛋白质相互作用对实现。然而现有的蛋白质相互作用对在实际应用时存在诸多问题。首先，强相互作用对的数量有限，目前常用的相互作用对的亲和力都不强，在构建较为复杂的多酶复合物时，结构不稳定，容易坍塌。其次，对于某些放热反应，如纤维素的降解，需要热稳定的蛋白质相互作用对结合热稳定酶来构建多酶复合物，目前此类蛋白质相互作用对更是少之又少。此外，大多数蛋白质相互作用对都需要在高盐离子条件下发生相互作用，如Cohesin-Dockerin的作用受钙离子调控，限制了它们在体内的应用。因此，针对以上问题挖掘具有优良性质的新蛋白质相互作用对具有重要意义。

大肠杆菌产生的大肠杆菌素是一种细胞毒素，可以杀死亲缘关系比较近的杆菌。大肠杆菌素E家族的DNA酶包括CE2、CE7、CE8和CE9，是一类结构高度相似的非专一性核酸内切酶。在宿主细胞中，CE蛋白与各自对应的免疫蛋白Im2、Im7、Im8和Im9结合，抑制CE蛋白与DNA的结合，从而消除它们对于宿主的毒性。CE蛋白和Im蛋白的结合是目前自然界已知最强的蛋白质相互作用之一，K_d达到10^-14～10^-17。Im与CE的结合为“双重识别机制”，即Im蛋白质首先通过保守元件(螺旋Ⅲ)与CE核酸酶形成序列无关的复合物；随后Im蛋白质上含有特异性残基的螺旋Ⅱ与对应的CE核酸酶结合，稳定正交复合物(Li W.,et al,Biochemistry.1998,37,11771-11779；Keeble AH,Kleanthous C.,J Mol Biol.2005,352,656-671)。

发明内容

本发明的目的在于提供基于大肠杆菌素E家族DNA酶的蛋白质复合物及其在人工蛋白支架中的应用，本发明通过对CE家族的DNA酶CE2、CE7、CE8和CE9的羧基端DNase结构域进行蛋白质工程改造，获得丧失DNA酶活性，但仍保留与对应Im蛋白的超高亲和力的突变体，并构建得到了CL2/Im2，CL7/Im7，CL8/Im8和CL9/Im9蛋白质相互作用对。研究发现这些蛋白质相互作用对具有耐热性，高亲和力，高特异性，分子量小，组装速度快等性质，基于此构建了人工蛋白质支架，为人工多酶复合物的构建搭建了新型平台。