[发明专利]高产生育三烯酚的重组工程菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明提供一种高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，该菌株含有重组质粒a和重组质粒b，其中，重组质粒a含有经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因，其编码的蛋白质包括对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶；重组质粒b含有经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因，其编码的蛋白质包括2‑甲基‑6‑香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ‑生育酚甲基转移酶。本发明通过对比和选择不同来源的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶，所得重组菌株的发酵培养物中，维生素E的产量可达到1255.3μg/gDCW，显著提高了重组解脂亚罗酵母菌的维生素E产能。

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种高产生育三烯酚的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产生育三烯酚中应用。

【背景技术】

维生素E是生育酚和生育三烯酚的总称，它是一种两亲性分子，由莽草酸途径来源的极性芳香族头部和亲脂性类异戊二烯侧链组成。根据侧链的饱和度和芳香环上甲基数目和位置的不同，分为α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚这8种化合物。

目前，维生素E制备方法主要有化学合成、生物提取和生物合成。化学合成法由于步骤太多、产率低、副反应多以及原料的制备技术和生产成本等问题直接影响着维生素E的产量和质量，不利于商业化生产。市面上的天然维生素E主要从植物油脱臭馏出物中提取，其中大豆油脱臭馏出物中α-生育酚含量相对较高，且原料来源丰富，产量大，是目前各国提取天然α-生育酚的最主要原料。生物合成法主要集中在对植物遗传工程的改造，以提高蔬菜和油料作物中维生素E的含量或各组分的比例。比如，在拟南芥中过表达大麦HGGT，使γ-生育三烯酚大量积累，生育酚和三烯酚总量提高10-15倍[CAHOON E B,HALL S E,RIPP KG,et al.Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants fortocotrienol production and increased antioxidant content(J].Nat Biotechnol,2003,21(9):I 082-7.]；在大豆中过表达拟南芥MPBQMT和γ-TMT，使α-生育酚比例提高到90％-95％等[VAN EENENNAAM A L,LINCOLN K,DURRETT T P,et al.Engineering vitaminE content:from Arabidopsis mutant to soy oil fJl.Plant Cell,2003,15(12):3007-19.]。另外，德国斯图加特大学的研究人员通过引入光合生物来源的生育三烯酚合成途径基因，对大肠杆菌进行了代谢改造，获得了产15μg/g(细胞干重)δ-生育三烯酚的工程菌株[ALBERMANN C,GHANEGAONKAR S,LEMUTH K,et al.Biosynthesis of the vitamin Ecompound delta-tocotrienol in recombinant Escherichia coli cells[J].Chembiochem,2008,9(15):2524-33.]，同一课题组在2013年又通过基因组整合和增强MEP途径，构建了产1425μg/g(细胞干重)生育三烯酚共同前体MGGBQ的工程菌株[GHANEGAONKARS,CONRAD J,BEIFUSS U,et al.Towards the in vivo production of tocotrienolcompounds:engineering of a plasmid-free Escherichia coli strain for theheterologous synthesis of 2-methyl-6-geranylgeranyl-benzoquinol[J].JBiotechnol,2012,164(2):238-47.]。然而，对于应用价值更高的γ-生育三烯酚，α-生育三烯酚或者α-生育酚的异源生物合相关研究更少，仅见于国内于洪魏团队沈斌的研究中[沈斌.酿酒酵母中异源合成维生素E(生育三烯酚)的研究[D].浙江大学,2019.]，以酿酒酵母为研究平台，克隆来源于拟南芥、蓝藻、烟草等的关键途径基因并结合密码子优化，结合酿酒酵母中内源的莽草酸途径和MVA途径，构建出异源合成维生素E(生育三烯酚)的代谢途径，获得了较高的产量，达到244.2μg/g干重，其中γ-生育三烯酚的产量为172.9μg/g干重，α-生育三烯酚为71.3μg/g干重。