[发明专利]高产生育三烯酚的重组工程菌株、其构建方法及应用

权利要求书

1.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒a和重组质粒b，其中，所述重组质粒a含有经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因编码的蛋白质包括对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶；所述重组质粒b含有经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因编码的蛋白质包括2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶。

2.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述对羟基苯基丙酮酸双加氧酶来源于荠菜、萝卜、白菜、山嵛菜和油菜。

3.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述尿黑酸植基转移酶来源于柠檬草、八爪草、发菜、小球藻和蓝藻。

4.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶来源于拟南芥。

5.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因来源于油菜，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述尿黑酸植基转移酶基因来源于小球藻，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于通过SD-ura培养基获得去除ura3标记的重组解脂亚罗酵母。

7.权利要求2-4中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的重组工程菌株

获取并合成来源于荠菜(CdHPPD)、萝卜(RsHPPD)、白菜(BrpHPPD)、山嵛菜(EsHPPD)和油菜(BrHPPD)的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因HPPD并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-CdHPPD、ploxpura3loxp-RsHPPD、ploxpura3loxp-BrpHPPD、ploxpura3loxp-EsHPPD和ploxpura3loxp-BrHPPD，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌中，所得重组工程菌株经PCR方式验证正确；

(2)构建含尿黑酸植基转移酶基因的重组工程菌株

获取并合成来源于柠檬草(LiHPT)、八爪草(AhHPT)、发菜(NopHPT)、小球藻(GaHPT)和蓝藻(HcHPT)的HPT基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因HPT并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-LiHPT、ploxpura3loxp-AhHPT、ploxpura3loxp-NopHPT、ploxpura3loxp-GaHPT和ploxpura3loxp-HcHPT，将构以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤(1)的重组工程菌株中，所得重组工程菌株经PCR方式验证正确；

(3)构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶基因的重组工程菌株

获取并合成源于拟南芥的2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因HPT并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-MPBQMT、ploxpura3loxp-TC和ploxpura3loxp-γ-TMT，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(2)的重组菌株中，所得菌株经PCR验证正确后得到高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于将所得重组解脂亚罗酵母在SD-LEU培养基上培养，所得的单菌落为去除ura3标记的重组解脂亚罗酵母。

9.权利要求1-6中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母在生产生育三烯酚中的应用。