[发明专利]一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的探针引物组合包括(a)SEQ ID NO.1‑3所示的第一组探针引物组合，(b)SEQ ID NO.4‑6所示的第二组探针引物组合。本发明提供的试剂盒可同时对PCV2感染、PCV3感染以及PCV2和PCV3感染实现一次性检出，减少常规方法耗时长、敏感性低且易出现假阳性问题，同时避免猪场共同感染样本因不同类型病毒浓度差异而影响病毒检出率，检测灵敏度高、特异性强，为猪圆环病毒的疫情监测和防控提供技术支持，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种鉴别PCV2 和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股负链、环状无囊膜的DNA病毒，根据其基因及抗原的差异性可将其分为3 种血清型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)以及新出现的猪圆环病毒3型(PCV3)。PCV1被认为对猪没有致病性；PCV2会导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍等疾病，给养猪业带来极大的威胁。PCV3为一种与猪皮炎和肾病综合征、生殖功能衰竭和多系统炎症相关的新型猪圆环病毒。 2016年Shen H等在中国广东省检测出了PCV3(PCV3-China/GD2016 株)，首次证实了PCV3在国内的存在，随后对国内许多省份进行了 PCV3的筛查，结果表明，PCV3在我国许多地区广泛流行。临床诊断中PCV3常与免疫抑制性病毒PCV2以双重感染的形式被检出，且感染PCV3的猪临床症状与PCV2非常相似，难以区分，为临床诊断和治疗带来极大的困难。

目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但这些常规方法耗时长、敏感性低且容易出现假阳性。在PCR检测方法中，只有单一的检测PCV2或PCV3，不能在一个反应中同时对PCV2与PCV3进行实时荧光PCR检测，因此建立一种快速、灵敏、准确的PCV2和PCV3的鉴别方法意义重大。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。

本发明提供了一种可以鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)以及猪圆环病毒3型(PCV3)的探针引物组合、试剂及试剂盒，该探针引物组合具有检测灵敏度高、特异性强、稳定性(或重复性)好的特点。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其包括第一探针引物组合和第二探针引物组合中的至少一种探针引物组合，第一探针引物组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一探针，第二探针引物组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二探针。

PCV2基因组全长1766bp-1768bp，目前已知有3个主要的开放阅读框ORF1、2、3，已经被证实，其中ORF1开放阅读框编码病毒的复制酶蛋白(Rep和Rep’)；ORF2开放阅读框主要编码病毒免疫原性蛋白即核衣壳蛋白(Cap)；ORF3开放阅读框位于ORF1内，虽然其编码的蛋白不是病毒复制过程中必需的，但是能够诱导宿主细胞凋亡。

PCV3的全基因序列长2000bp，目前已知有3个主要的开放阅读框ORF1、2、3，其中的ORF1和ORF2分别编码病毒的Rep蛋白和Cap蛋白。

通过同源性比对，结果表明：编码Cap蛋白的ORF2基因是PCV2 和PCV3之间差异性最高的基因，因此该基因是特异性地鉴别PCV2 和PCV3的最佳靶基因。本发明分别选取PCV2ORF2基因和PCV3 ORF2基因的保守区域设计荧光探针和引物序列。